Création du modèle de peau innervé vascularisé et immunocompétente par génie tissulaire

Ce protocole présente la construction du modèle de peau dite « complète », contenant un derme, fait de fibroblastes (F), des pseudo-vaisseaux formés à partir de cellules endothéliales (E), un épiderme stratifié composé de kératinocytes (K), une innervation sensorielle générée à partir de neurones provenant de ganglions de la racine dorsale d’embryons murins (DRGs) ou de neurones humains dérivés d’iPSCs, et enfin d’une immunocompétence composée de cellules dendritiques dérivés de monocytes sanguins humains (MonoDCs). Ce modèle complet est abrégé F + E + K + DRGs (ou neurones-iPSCs) + MonoDCs, résumant ses différents composants.

1.4.1 Formation du derme vascularisé (14 jours)

L’éponge de culture de collagène-chitosan est stérilisée toute la nuit à 4°C dans de l’éthanol ou de l’isopropanol à 70%. Un maximum d’alcool est enlevé et remplacé avec 4mL par puits de DMEM vierge supplémenté avec 300U/mL de Pénicilline, 75 µg/mL de Gentamycine et 15µg/mL de Fungizone. Les plaques sont incubées toute la nuit à 37°C. Le DMEM supplémenté en antibiotique et antifungique est enlevé et remplacé par du DMEM vierge. Les plaques sont de nouveau placées à 37°C, au minimum pour une nuit, et maintenues à 37°C avant l’ensemencement des cellules.

Au jour 0, 800 000 fibroblastes et 800 000 cellules endothéliales sont ensemencées à la surface de l’éponge

de collagène-chitosan dans 100µL de milieu de culture et incubées 2h à 37°C. Le puits est complété avec 3mL de mélange volume/volume de EBM-2 / DMEMc +50µg/mL d’acide ascorbique. Les cellules à ensemencer ne sont pas directement décongelées, elles nécessitent une pré-amplification en flacon pendant une semaine avant l’ensemencement en éponge. Le milieu de culture est changé tous les 2 à 3 jours. Le rouge de phénol présent dans le milieu de culture va servir d’indicateur de prolifération, si ce dernier passe du rouge-orangé (pH7,4 lorsque le milieu contient tous ses nutriments), à jaune (pH acide, lorsque les nutriments du milieu ont été consommées par les cellules), les éponges sont placées en plaques 6 puits pour augmenter le volume de milieu de culture (4 ou 5mL).

Au jour 7, l’éponge est retournée et 450 000 fibroblastes et 450 000 cellules endothéliales sont ensemencées

à la surface de l’éponge dans 100µL de milieu de culture et incubées 2h à 37°C. Le milieu de culture est un mélange 1 :1 (volume/volume) de EBM2 et DMEMc, +50µg/mL d’acide ascorbique, en quantité suffisante pour la taille du puits. Le milieu doit être changé tous les 2-3 jours. Le derme sera complet, vascularisé et homogène à la fin de cette étape.

1.4.2 Formation de l’innervation (14 jours)

Au jour 14, étape d’ensemencement des neurones, l’éponge est maintenue en interface air-liquide par un

support circulaire en plastique sur lequel repose l’anneau d’ancrage en papier. Le support circulaire est dentelé de façon à permettre un passage du milieu en dessous de l’éponge. Cette étape se fait impérativement en plaque 6 puits et le volume de milieu de culture est de 4mL.

Pour les neurones murins, 800 000 cellules extraites de DRGs murins au stade E12,5 sont ensemencées dans 100µL de milieu de culture au-dessus de l’éponge en interface air-liquide, avec un milieu DMEMc supplémenté avec 50µg/mL d’acide ascorbique et 10ng/mL de NGF. Le milieu de culture doit être changé tous les 2-3 jours pendant 14 jours.

Pour les neurones humains, 800 000 neurones dérivés d’iPSCs humain au stade Jour 11 sont ensemencés dans 100µL de milieu de culture au-dessus de l’éponge en interface air-liquide avec un milieu DMEMc supplémenté avec 50µg/mL d’acide ascorbique, 20ng/mL de BDNF, 10ng/mL de GDNF et 10ng/mL de NGF. Le milieu de culture doit être changé tous les jours pendant 7 jours puis tous les 2-3 jours pendant 7 jours.

1.4.3 Formation de l’immunocompétence (7 jours)

Au jour 28, l’éponge est retournée pour que les corps cellulaires des neurones soient face au fond du support

de culture, sans support air-liquide.

200 000 MonoDCs au stade J5, c’est-à-dire différenciées et caractérisées, sont ensemencées dans 100µL de milieu de culture au-dessus de l’éponge et incubées 2h à 37°C, avant de rajouter 4 à 5mL de milieu de culture.

La composition des suppléments du milieu de culture dépend des neurones présents dans l’éponge. Si aucun neurone n’est présent à ce stade de l’éponge, le milieu de culture sera du DMEMc supplémenté avec 50µg/mL d’acide ascorbique. Le changement de milieu se fait tous les 2-3 jours.

1.4.4 Formation de l’épiderme (21 – 28 jours)

Au jour 35, 800 000 kératinocytes préamplifiés en flacon de culture et à 80% confluence sont ensemencés au-

dessus de l’éponge (préalablement débarrassée de son milieu de culture) dans 100µL de milieu de culture, incubé 2 à 3 heures à 37°C. Le milieu de culture à ajouter par la suite (4 à 5 mL) est du DHc supplémenté avec 50µg/mL d’acide ascorbique. Les autres suppléments à ajouter dépendent du type de neurones déjà présent dans l’éponge (10 ng/mL de NGF pour les neurones murins, 20ng/mL de BDNF, 10ng/mL de GDNF et 10ng/mL de NGF pour les neurones humains). Le milieu est à changer tous les 2-3 jours pendant 7 jours.

Au jours 42, l’éponge est placée en interface air-liquide sur son support dentelé avec un volume de 3,5mL de

milieu. Cette étape permet la différenciation des kératinocytes pour la formation des différentes couches de l’épiderme, grâce au contact directe des cellules avec l’air, le dessus de l’éponge ne devant plus être humidifié à partir de cette étape. Le milieu de culture est composé de DMEM-F12 supplémenté avec 5% de SVF, 5 mg/mL d’insuline bovin ; 0,4 mg/mL d’hydrocortisone et 1.10-10 _{M de toxine du choléra (l’EGF ayant été enlevé par} rapport au milieu précédent). Les autres suppléments à ajouter dépendent du type de neurones déjà présent dans l’éponge. Le milieu est changé tous les 2-3 jours jusqu’à formation de l’épiderme. Ce processus peut prendre entre 14 et 21 jours, dépendamment de la compétence des kératinocytes à se différencier.

1.4.5 Peau normale humaine, innervée, vascularisé et immunocompétente (iV-

ITES)

Figure 22 : Schéma récapitulatif de la construction du modèle de peau complet, innervé, vascularisé et immunocompétent.

Un total de 56 à 63 jours de culture 3D à partir du support sont nécessaire pour reconstruire, par génie tissulaire, le modèle de iV-ITES.