L’objectif principal de ce travail est de mieux comprendre les anomalies du développement alvéolaire dans le cadre d’un RCIU. L’approche choisie a été mixte à la fois fondamentale et clinique.
I- Etude fondamentale
En ce qui concerne la partie fondamentale de ce travail, la première partie du travail a consisté à identifier un modèle de RCIU donnant des anomalies de l’alvéolisation durables. Pour ce, nous avons bénéficié de la collaboration de trois équipes françaises ayant travaillé préalablement sur le RCIU. Etant donné les résultats discordants obtenus dans les études pré- cédentes dans plusieurs espèces, nous avons choisi de nous intéresser à une seule espèce ani- male : le rat Sprague Dawley.
Nous avons choisi d’étudier :
‐ le modèle de restriction de croissance par restriction protidique déjà utilisé et décrit par l’équipe d’U Simeoni. Ce régime comporte 9% de protides prove- nant de la caséine contre 23% dans le régime contrôle. Les régimes sont iso- caloriques grâce à l’augmentation du ratio d’amidon de maïs dans le régime hypoprotidique.
Ce régime est administré pendant toute la durée de la gestation à la mère et poursuivi jusqu’à deux jours après la naissance. Les ratons restent avec leur propre mère jusqu’à leur sacrifice post-natal. Les portées sont homogénéisées à 10 pour diminuer le risque d’apparition d’un retard de croissance extra- utérin ;
‐ le modèle de restriction de croissance par L-NAME déjà utilisé et décrit par l’équipe des Pr Storme et Deruelle : implantation d’une pompe mini- osmotique par voie sous-cutanée en inter-scapulaire. La pompe délivre en continu le L-NAME ou du sérum physiologique. L’insertion est réalisée sous anesthésie générale au 17ème jour de gestation. Au deuxième jour de vie post- natale, les ratons sont adoptés. Les portées sont homogénéisées pour dimi- nuer le risque d’apparition d’un retard de croissance extra-utérin ;
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‐ le modèle de ligature unilatérale de l’artère intra-utérine décrit par l’équipe du Pr Baud. Au dix septième jour de vie, la rate est anesthésiée et l’artère utérine droite est ligaturée après la première arcade. Les ratons restent avec leur propre mère jusqu’à leur sacrifice post-natal.
En fonction des laboratoires où les manipulations ont été effectuées les rats provenaient de l’animalerie Charles River (Modèle restriction protidique) ou de l’animalerie Janvier (Modèle ligature unilatérale de l’artère utérine ou modèle L-NAME).
Afin d’étudier le développement alvéolaire dans sa globalité et là encore en raison des résultats discordants entre les différentes études, nous avons étudié les poumons en morpho- métrie (analyse histologique) avant, pendant et à la fin de l’alvéolisation, c’est-à-dire respec- tivement aux 4ème, 10ème et 21ème jours de vie post-natale.
En cas de trouble de l’alvéolisation, une analyse génomique a été réalisée par qPCR selon une approche gène candidat concernant 13 des principaux gènes impliqués dans l’alvéolisation que ce soit dans la formation des alvéoles elles-mêmes ou dans le développe- ment vasculaire.
La deuxième partie de l’étude fondamentale s’est intéressée au modèle de restriction de croissance intra-utérine induit par restriction protidique. Une approche multi-génique a été menée aux trois temps du développement alvéolaire préalablement décrits (4ème, 10ème et 21ème jours de vie post-natale). Des puces à ARN Agilent ont été réalisées dans les poumons totaux poolés.
En fonction des résultats génomiques obtenus une analyse protéique complémentaire ainsi qu’une analyse histologique ont été réalisées.
II- Approche clinique
Une base de recueil de données a été constituée dans le service de Médecine Néonatale de Port-Royal pour effectuer un travail de recherche préliminaire sur le lien entre DBP et RCIU chez des enfants nés d’une grossesse compliquée par des anomalies vasculaires (prééclamp- sie, dopplers utérins pathologiques) nés à la maternité Port-Royal à un terme inférieur à 28SA entre 2005 et 2009. Ce travail a été effectué dans le cadre d’une thèse de Médecine par MS Aubelle (Chef de Clinique dans le service de Médecine Néonatale). Cette base de données,
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validée, regroupe l’ensemble des complications néonatales classiquement observées en cas de RCIU et les données maternelles. Etant donné le lien fort retrouvé entre RCIU et DBP dans cette étude, avec une multiplication du risque de DBP par 6 en cas de RCIU, un projet de re- cherche clinique a été élaboré pour étudier le lien entre facteurs anti-angiogéniques circulants et DBP. Ce projet a bénéficié du soutien financier de l’AP-HP, promoteur de l’étude, dans le cadre d’un contrat de recherche clinique obtenu en 2011, sous la direction scientifique du Pr J Guibourdenche. Les patientes atteintes de prééclampsie avant 30SA, dont le fœtus est porteur de RCIU, sont recrutées à la maternité Port-Royal (maternité de type III, 6 000 naissances/an) ou à l’hôpital Robert Debré (maternité de type III) avant l’accouchement.
1) Hypothèse et objectifs
a) Hypothèse principale
Les récepteurs solubles, sFlt-1 et sEng sont sécrétés par le placenta et passent dans la circula- tion fœtale où ils bloquent leurs ligands respectifs, le VEGF et le TGF-β. La diminution con- sécutive de la fraction libre de ces ligands perturberait le développement pulmonaire normal.
b) Objectifs :
‐ mesurer le taux de sFlt1 dans le sang maternel et regarder s’il est corrélé à l’existence d’une DBP à 36SA chez les prématurés nés avant 30SA, atteints de RCIU à la suite d’une prééclampsie.
‐ déterminer si une concentration élevée de récepteurs solubles circulants et une concentration diminuée de leurs ligands dans le sang fœtal et maternel et/ou dans le liquide amniotique est corrélée avec la survenue d’une DBP ainsi que les complications les plus fréquentes observées en cas de RCIU (thrombopé- nie, entérocolite ulcéro-nécrosante, infection …)
A terme, le but de cette étude est d’identifier précocement les nouveau-nés à risque de déve- lopper une DBP afin d'envisager des thérapeutiques précoces et ciblées sur les enfants les plus à risque.
2) Modalités pratiques
a) Prélèvements
En cas de prééclampsie, les mères sont hospitalisées pour surveillance clinique (notam- ment de la pression artérielle) et biologique (fonctions hépatique et rénale et numération for-
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mule sanguine). Au cours d’un des prélèvements maternels, lors de l’hospitalisation et au moment de l’anesthésie pré-opératoire, un tube supplémentaire sera prélevé. Au moment de la césarienne, un prélèvement de sang de cordon et de liquide amniotique sera également réalisé.
b) Dosages et méthodes de dosage
Le sFlt-1, le VEGF, le PlGF et la sEng seront dosés par technique ELISA grâce à des kits (Enzyme-linked immunosorbent assay) conformément aux instructions du laboratoire R&D.
3) Confrontation entre les données biologiques et cliniques
a) Base de données
Il s’agit d’une base Epi-Info conforme à celle mise au point par le Dr Aubelle.
b) Critères d’inclusion et de non-inclusion
Les critères d’inclusions sont les suivants: patiente enceinte de moins de 30SA et at- teinte de prééclampsie, dont le fœtus est atteint de RCIU à l’échographie obstétricale, âgée de plus de 18 ans et bénéficiaire (ou ayant droit) de la Sécurité Sociale. L’existence de patholo- gies inflammatoires maternelles ou fœtales, la présence de signes cliniques ou biologiques d’infection et un foetus eutrophe sont des critères de non inclusion.
Le protocole sera proposé à 60 mères, pour tenir compte des éventuels refus d’inclusion, des données manquantes et du taux élevé de mortalité précoce chez les enfants atteints de RCIU. En effet, le diagnostic respiratoire n’étant fait qu’à 36SA d’âge corrigé, le décès pré- coce de certains enfants les fera sortir de l’étude.
c) Nombre de sujets nécessaires et analyse statistique
Selon des résultats préliminaires, 50 % des prématurés hypotrophes nés avant 30SA et issus de mères pré-éclamptiques sont atteints de DPB à 36SA. Notre hypothèse est que le taux moyen de sFlt-1 dans le sang maternel est deux fois plus élevé, environ 6000 pg/ml chez les prématurés atteints de DBP. Le nombre de sujets nécessaires pour montrer un doublement de la moyenne de sFlt-1 dans le sang maternel chez les RCIU avec DBP issus de mère pré- éclamptiques par rapport à la moyenne des RCIU sans DBP issus de mère pré-éclamptiques (< 30 SA) avec un risque de première espèce de 0,05 et une puissance de 80 % (test bilatéral) et un écart-type de 2500 pg/ml est de 12 enfants dans chaque groupe.
L’ensemble de ces données sera analysé en univarié puis en multivarié. Un t-test de Student de comparaison sera effectué entre les deux groupes (avec ou sans DBP) pour compa- rer les taux des différents marqueurs biologiques étudiés. Une différence significative sera notée si p<0,05. L’analyse statistique sera effectuée grâce au logiciel SAS.
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Partie 3: Résultats
La partie « Résultats » comprend des articles (publié ou soumis).
J’ai réalisé des articles de revue de la littérature, les publications correspondantes sont dans la partie « annexe »
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