NsP3 interagit avec le domaine HelicC de DHX9

Puisque DHX9 est relocalisée dans les complexes de réplication, nous avons évalué le rôle des protéines non-structurales dans le recrutement de DHX9 dans les compartiments de replication. Des constructions de chacune des protéines non-structurales contenant un tag GFP en partie N-terminale ont été réalisées par clonage. Ces constructions ont été transfectées dans des cellules HEK293T cultivées sur des lamelles. Un marquage de DHX9 a ensuite été effectué. Après montage, les lamelles ont été observées au microscope confocal (Figure 45A). La protéine nsP1 exprimée les HEK293T est relocalisée aux membranes cellulaires alors que la localisation nucléaire de DHX9 reste inchangée. L’hélicase virale nsP2 est retrouvée dans les compartiments nucléaires et cytosoliques sans co-localiser avec DHX9. Lorsque nsP3 est exprimée dans les cellules transfectées, elle forme des granules cytoplasmiques où est redistribuée DHX9. La polymérase virale nsP4 est exprimée de manière diffuse dans le cytoplasme des cellules mais aussi parfois dans foyers concentrés sans jamais pour autant localiser avec DHX9. Dans ce contexte, seule nsP3 est co-localisée avec DHX9. Il est à noter cependant, que le marquage de DHX9 en présence de GFP-nsP2 est réduit dans les cellules exprimant cette protéine virale.Nous avons alors émis l’hypothèse que l’activité NTPase de nsP2 ayant de fortes affinités pour l’ATP et le GTP (Karpe et al. 2011) modifiait la conformation de DHX9, ne pouvant plus lier le GTP dans le noyau. La conformation de l’hélicase étant modifiée, l’anti-DHX9 ne reconnaitrait plus son épitope en partie C-terminale de DHX9. Parallèlement, Nous avons observé en complémentant la cellule en GTP, grâce à l’apport de guanosine, la réapparition du marquage de DHX9 nucléaire (Figure 46).

Nous avons ensuite cherché à savoir si DHX9 pouvait interagir avec les nsPs et surtout si la co-localisation de nsP3 avec DHX9 était allouée à une interaction entre ces deux protéines. Les constructions de plasmides codant pour les GFP-nsPs et un pcDNA3.1 contenant la séquence de DHX9 fusionnée à un tag Hémagglutinine (HA) en N-terminal ont alors été co-transfectées dans des HEK293T. Les extraits protéiques des cellules transfectées, lysées sont ensuite mis en contact avec des billes d’agarose couplées à des anticorps ciblant le tag HA. Les complexes immuno-précipités sont déposés sur gel d’acrylamide et migrés par western-blot. Seule GFP-nsP3 est identifiée comme étant liée à HA-DHX9 par cette technique (Figure 45B), confirmant alors les résultats obtenus par colocalisation. Ce résultat est également en accord avec l’étude de double hybride menée par Bouraï et ses collaborateurs dans laquelle nsP3, uniquement, semble pouvoir lier DHX9 (Bourai et al. 2012).

89

Figure 45: NsP3 est la protéine non-structurale interagissant avec DHX9. (A) des cellules HEK293T ont été transfectées soit par un peGFP-C1 control soit par des constructions permettant de coder pour les différentes GFP-nsPs. Les cellules fixées à la PFA 24h post transfections sont immuno-marquées par l’anti-DHX9 au 1/500 et observées au microscope confocal. La barre blanche représente 5µM (B) Les constructions codant pour les GFP-nsPs et un pcDNA3.1 contenant la séquence de DHX9 fusionnée à un tag Hémagglutinine (HA) en N-terminal ont été co-transfectées dans des cellules HEK293T. Une partie du lysat protéique a été déposée pour contrôler l’expression des plasmides transfectés tandis que 200µg d’extrait protéique a été immuno-précipité avec des anti-HA (souris) couplés à des billes d’agarose. Les protéines liées à DHX9 sont identifiées par Western-Blot.

90

Figure 46: L’activité NTPase de nsP2 entraine une diminution de marquage de DHX9. Des cellules HeLa ont été transfectées avec peGFP-C1 ou GFP-nsP2 et traitées à la ribavirine 200µM (connue pour entrainer la

91

disparition de GTP dans la cellule cible) ou à la guanosine 50µM pour complémenter les cellules en GTP. Les cellules ont été marquées avec un anti-DHX9 couplé à un anticorps secondaire Alexa 594 et ont observées au microscope droit à fluorescence L’intensité du marquage de DHX9 a été analysé grâce au logiciel ImageJ.

NsP3 étant retrouvée comme interagissant avec DHX9, nous avons voulu préciser le site d’interaction de nsP3 dans DHX9. Cette cartographie a été entreprise en co-transfectant nsP3 et des constructions de HA-DHX9 tronquées dans les domaines caractéristiques d’une protéine à domaine DExD/H (précédemment caractérisées par Zhang et al, 2011), dans des HEK293T (Figure 47A). Les lysats protéiques ont été immuno-précipités avec des billes d’agarose couplées à des anticorps ciblant le tag hémagglutinine. Les complexes formés sont ensuite déposés et migrés par Western-Blot. L’anti-nsP3 permet de révéler la liaison de la phosphoprotéine virale avec la construction de DHX9 co-transfectée. Ainsi, nsP3 peut se lier sur DHX9 privée de sa partie C-terminale (HA-DHX9ΔHD), de sa partie N-terminale privée du domaine de liaison des ARNs double-brins (HA-DHX9ΔDSRM), et du domaine hébergeant le motif B Walker (HA-DHX9ΔDExDc). Par contre, nsP3 ne peut être retrouvée associée avec la construction de DHX9 délétée du domaine C-terminal hélicase présent chez les hélicases de type RecA-like (Figure 47B). NsP3 lie donc DHX9 sur le domaine C-terminal hélicase.

92

Figure 47: Le domaine C-terminal hélicase de DHX9 est nécessaire à la liaison de nsP3. (A) Les constructions tronquées de DHX9 tagguées HA décrites par Zhang et collaborateurs, 2011 ont été co-transfectées avec GFP-nsP3 dans des HEK293T. (B) 24h post-transfection les cellules sont lysées, et une partie de l’extrait est migré par Western-Blot (input) tandis que 200µg d’extraits protéiques sont mis au contact avec des billes d’agaroses couplées à des anti-HA. Les complexes immuno-précipités sont ensuite déposés sur gel d’acrylamide et la présence de nsP3 dans ceux-ci sont révélés par Western-Blot.

93

3) DHX9 est impliquée dans la traduction de l’ARN