F-2.c- Notion de régénération

Différentes options de régénération sont envisageables : Si le ligand est assez stable, alors la puce peut être régénérée entre chaque injection. Cela sous-entend que l’analyte doit être dissocié de sorte à retrouver une surface de capture initiale, mais que le ligand en revanche, lié de manière covalente, doit rester lié à la sensor chip et sa fonctionnalité rester intègre, et cela en dépit des injections répétées. Dans ce cas, les conditions de régénération doivent être à la fois suffisamment douces pour ne pas altérer la puce, mais néanmoins suffisamment drastiques pour éliminer complètement les molécules d’analyte encore liées à la surface. Classiquement, une solution acide, glycine HCl 10mM à pH ≤ 3, ou inversement une solution basique tel que NaOH (1 à 100mM) sont utilisées.

C’est l’approche que nous avons utilisée lorsque le ligand était l’anticorps commercial AD4G2 ou MC10E7, les IgG étant réputées stables (mode Multiple cycle, Steady state). La solution de régénération utilisée dans ces cas a été NaOH 2.5 mM, injecté à un débit de 10 µl/min pendant 1 minute. Le protocole détaillé est indiqué en annexe I-11.b.

Si en revanche le ligand est peu stable, alors la puce peut ne pas être régénérée entre chaque injection. Pour cela on utilise le mode « Single cycle kinetic ». Celui-ci permet d'injecter des concentrations croissantes successives d’analyte et tient compte, après chaque injection, du nombre de sites de capture encore disponibles, afin in fine de calculer les paramètres cinétiques d’interaction. Cette approche

R

= x R^Mw

x S

Mw

101 s’avère tout à fait pertinente lorsque les conditions de régénérations sont difficiles à développer. Les différents essais développés ont montré qu’après régénération, le risque de perdre la fonctionnalité des scFv était important. Pour cette raison, nous avons retenu le mode Single cycle kinetic lorsqu’un scFv était utilisé comme ligand, contrairement à l’approche suivie pour les anticorps entiers (IgG).

III.F-2.d- Résultats de SPR sur les anticorps commerciaux et les scFv sélectionnés. Analyse des anticorps commerciaux AD4G2 et MC10E7

Une analyse des anticorps AD4G2 et MC10E7 est essentielle. Outre le fait que ces anticorps constituent des témoins positifs de nos expériences, déterminer leurs KD respectifs permettra de disposer de valeurs de références, dans des conditions expérimentales similaires à celles des scFv sélectionnés. En outre, le format d’immobilisation choisi (à savoir les anticorps ou scFv immobilisés (ligand) vs la MC-LR circulante (analyte)) permet de s’affranchir de l’impact de l’avidité éventuellement liée à la bivalence des IgG sur l’estimation de la constante de dissociation à l’équilibre KD, justifiant ainsi de comparer les scFv et les IgG à valence équivalente.

D’un point de vue expérimental, les anticorps ont donc été injectés sur la puce CM5 à un débit de 3 µl/min pendant 8 minutes jusqu’à atteindre un niveau d’immobilisation de 20772 RU pour AD4G2 et 20745 RU pour MC10E7. Les Rmax théoriques pour AD4G2 et MC10E7 sont donc respectivement de 275.6 et 275.3 RU. Puis différentes concentrations de MC-LR, variant de 0 à 10 nM sont injectées à 10 µl/min pendant 5 minutes. Après chaque injection, la puce est régénérée par injection de 10 µl de tampon de NaOH 2.5 mM à 10 µl/min. Les sensorgrammes ainsi obtenus sont traités avec le logiciel BIAeval permettant un ajustement des données expérimentales à un modèle mathématique. Les sensorgrammes présentés dans la figure III-32 montrent les interactions spécifiques de l’AD4G2 et du MC10E7 vis-à-vis de la MC-LR, après soustraction des signaux non spécifiques obtenus sur la piste référence.

102 B)

Figure III- 32: Interaction entre la MC-LR et les anticorps commerciaux AD4G2 (A) et MC10E7 (B). Résultats de

SPR alignés grâce au modèle « Steady State Affinity ». En encadrés, les sensorgrammes expérimentaux respectifs résultant d’injections répétées de MC-LR à des concentrations variant de 0 à 10nM.

L’analyse de ces résultats a permis de déterminer des KD de 0.33 nM et de 0.15 nM respectivement pour AD4G2 et MC10E7 (Tableau III-8), suggérant une interaction de forte affinité pour la MC-LR. A noter que ces valeurs sont conformes ou proches de celles obtenues par Zeck et al (2001-A et B), à savoir 0.33 nM et 0.06 nM, respectivement pour AD4G2 et MC10E7 (Chap 2 Tableau II-3). Les valeurs de Chi2 sont faibles et permettent de valider la pertinence du fitting. Enfin, les Rmax mesurés sont de 46.9 et 52.3 RU respectivement, soit inférieurs aux Rmax théoriques cités précédemment. Ces observations restent fréquentes et ne remettent pas en cause la validité des résultats.

Tableau III-8: Résultats de l’analyse par SPR menée sur les anticorps commerciaux vis-à-vis de la MC-LR,

déterminés par le logiciel BIAevaluation en appliquant le modèle « Steady State Affinity ».

IgG KD (nM) Rmax mesuré (RU) Chi2

AD4G2 0.33 46.91 8.41

MC10E7 0.15 52.27 7.84

103

Analyse des scFv sélectionnés

 Cas du scFv 3A8

Comme indiqué dans le paragraphe relatif à la notion de régénération, les scFv sont trop peu stables pour supporter les conditions de régénération sans risquer d’induire une perte totale ou partielle de leur fonctionnalité. Nous avons donc eu recours à la méthode Single Cycle Kinetics afin de nous affranchir des étapes de régénération. Le logiciel BIAcore T100 Evaluation Software calcule ainsi la constante d’association à partir de cinq injections successives.

50µg/ml de scFv 3A8 dilués en acétate de sodium 10 mM pH 3.5 ont été injectés sur la puce CM5 à un débit de 3 µl/min pendant 8 minutes, jusqu’à atteindre un niveau d’immobilisation de 3 500 RU, induisant un Rmax théorique 124 RU. Cinq concentrations croissantes successives de MC-LR ont ensuite été injectées à 10 µl/min pendant 500 secondes (50 - 150 -300 - 500 et enfin 750 nM). Le protocole détaillé est indiqué en annexe I-11.c. Le sensorgramme obtenu avec 3A8 est présenté en figure III-33. Un traitement de ces données par BIAeval a permis d’obtenir les données référencées dans le tableau III-9, suggérant une affinité de 3A8 pour la MC-LR de l’ordre de 75.5 nM. Ce résultat reflète une bonne affinité, mais est inférieur à ce qui a été observé avec les anticorps de références AD4G2 ou encore MC10E7. Le Rmax mesuré reste assez proche du Rmax théorique (respectivement 110.6 RU et 124 RU), mais le Chi2 est pour sa part relativement élevé.

Figure III- 33: Analyse et paramètres d’affinité du 3A8 pour la MC-LR représentés respectivement. A)

Sensorgramme expérimental obtenu par la méthode Single Cycle Kinetics.

 Cas des scFv SOMa, SOKMc3 et SOKMc5

Nous avons procédé à plusieurs essais pour immobiliser ces 3 scFv sur une puce CM5, en utilisant les conditions expérimentales appliquées avec succès sur 3A8. Toutefois, ces tentatives se sont révélées Tableau III- 9: paramètres obtenus grâce au modèle « Steady State Affinity ».

scFv KD (nM) Rmax mesuré (RU) Chi2

104 infructueuses. Il y a pour cela deux hypothèses possibles, comme le cofirme le support technique de Biacore :

- Soit le tampon d’immobilisation choisi, bien que très classique (acétate de sodium 10 mM pH compris entre 3.5 et 8), est inadapté et ne permet pas de créer une quelconque attraction entre la

sensor chip et le ligand,

- Soit les scFv ici testés sont mal repliés, générant l’exposition inhabituelle de charges ou de zone hydrophobes, induisant à nouveau une non-attraction électrostatique des scFv sur la puce CM5. Afin de tester la première hypothèse, l’outils « pH-scouting » du système BIAcore a été exploité, en balayant des pH variant de 3,5 à la valeur du pI du scFv concerné. Aucune des conditions testées ne nous a permis d’immobiliser les scFv. En ce qui concerne la salinité du tampon d’immobilisation, les recommandations commerciales préconisent un tampon faiblement salin où la concentration en NaCl doit être inférieure à 50 mM. Notre dernier tampon de dialyse est un tampon phosphate 0,1M, cela ne doit pas en principe impacter la concentration en NaCl. Mais au regard de la littérature, nous avons fait varier le dernier tampon de dialyse de notre procédé de renaturation afin d’avoir directement le scFv dans le tampon d’immobilisation (Devlin et al., 1995). Deux options ont été testées, à savoir (i) une dernière dialyse directement en acétate de sodium 10 mM avec balayage de différents pH (de 3.5 jusqu’au pI du scFv concerné), ou (ii) une dernière dialyse en tampon de course BIAcore (HBS-P). Là encore, aucune des conditions testées n'a permis d’immobiliser les scFv.

Il semble donc que la renaturation des scFv soit en cause dans cette expérimentation. Un travail de fond sur la renaturation s’avèrere nécessaire. Il implique en particulier une amélioration des conditions de renaturation des scFv et une optimisation de plusieurs facteurs en particulier le pH et la concentration d'arginine et son temps d'action.