Normalisation

La normalisation est un processus destin´e `a identifier et supprimer des diff´erences, dues `

a des biais techniques, entre les ´echantillons. Il est donc important de commencer par cette ´

etape avant de chercher `a analyser les donn´ees de s´equenc¸age. Le nombre de reads align´es pour un g`ene j et un ´echantillon donn´e est une mesure relative (non absolue) de l’expression du g`ene. Ce nombre d´epend de la taille de la librairie Ni.

Transformation Packages R Transformations classiques

Logarithmique, racine carr´ee et arcsin disponible dans la version de base Box-Cox MASS [218], bestNormalize [161]

Blom RNOmni Stabilisation de la variance voom limma [171] VST DESeq2 [139] rlog DESEq2 Classification Transformation propos´ee par [88] pas de package Transformation pour profil d’expression coseq [169]

Approcher une distribution de Poisson Transformation puissance PoiClaClu

Tableau 2.1 R´ecapitulatif des packages R possibles pour les transformations.

Pour pouvoir comparer des expressions de g`enes entre plusieurs r´eplicats, il convient de prendre en compte le nombre total de reads align´es pour chaque ´echantillon Ni. Un exemple de ce biais est illustr´e par le tableau 2.2 et la figure 2.1.

Comptages bruts

g`ene 1 g`ene 2 g`ene 3 . . . nombre total de reads ´

echantillon 1 77 61 120 . . . 1000

´

echantillon 2 157 122 244 . . . 2000 Comptages divis´es par le nombre total de reads de l’´echantillon

g`ene 1 g`ene 2 g`ene 3 . . . nombre total de reads ´

echantillon 1 0.077 0.061 0.12 . . . 1000 ´

echantillon 2 0.0785 0.061 0.122 . . . 2000

Tableau 2.2 Influence de la taille de librairie Nisur le nombre de reads.

gène 1 pour l'échantillon 1 gène 1 pour l'échantillon 2

Figure 2.1 Influence de la taille de librairie Ni sur le nombre de reads. Ici, la profondeur de

s´equenc¸age est plus ´elev´ee pour l’´echantillon 2. Le g`ene 1 est donc exprim´e de mani`ere similaire dans ces deux ´echantillons.

Il existe un certain nombre de m´ethodes de normalisation pouvant ˆetre r´eparties en diff´erentes familles : l’ajustement de la distribution, la prise en compte de la longueur du g`ene et le concept du nombre total de reads effectifs.

Le principe g´en´eral des m´ethodes de normalisation est le mˆeme. L’objectif est de calculer un facteur de correction, Ci, pour chaque ´echantillon. Chaque comptage est alors multipli´e par le facteur correctif correspondant `a son ´echantillon. Les tailles de librairies pour les comptages normalis´es sont alors approximativement ´egales. G´en´eralement, les m´ethodes cherchent `a d´efinir un facteur d’´echelle, siavecQ

n

i=1si= 1, qui permet de d´efinir une taille

de librairie corrig´ee, ˜Ni= si× Ni`a partir de laquelle les comptages normalis´es (comptage par millions) sont obtenus avec :

˜ xij = xij ˜ Ni × 106_.

Ajustement des distributions

La m´ethode de normalisation na¨ıve consiste `a diviser chaque comptage d’un ´echantillon

ipar la taille de librairie de cet ´echantillon i, ce qui revient `a choisir si = 1pour tout i. Cette m´ethode s’appelle le comptage total [142].

Cependant, les tailles de librairies sont influenc´ees par un nombre restreint de g`enes fortement exprim´es. Cela a pour cons´equence des distributions tr`es asym´etriques. Pour rem´edier `a ce probl`eme, des variantes de cette m´ethode existent, comme la normalisation par la m´ediane ou par les quantiles. Par exemple, pour la m´ethode des quantiles, le facteur d’´echelle est d´efini par :

si= Q(k)_i n q Qn l=1Q (k) l

o`u Q(k)<sub>i</sub> est le quantile choisi de la distribution des comptages dans l’´echantillon i. G´en´eralement le quantile choisi est le troisi`eme quartile et cette normalisation est connue sous le nom upper-quartile[33].

Prise en compte de la longueur du g`ene

Pour comparer l’expression de diff´erents g`enes au sein d’un ´echantillon donn´e, il est important de corriger le biais induit par la longueur du g`ene sur laquelle les fragments sont align´es car, pour un mˆeme niveau d’expression, un long transcrit aura plus de chances d’ˆetre s´equenc´e et donc plus de reads associ´es qu’un transcrit plus court. Un exemple de ce biais est illustr´e avec la figure 2.2.

gène 1 pour l'échantillon i gène 2 pour l'échantillon i

Figure 2.2 Influence de la longueur Ljdes g`enes sur le nombre de reads.Le g`ene 2 est deux fois

plus long que le g`ene 1 et produit par cons´equent deux fois plus de fragments. N´eanmoins, en terme de niveau d’expression, les deux g`enes sont exprim´es de la mˆeme fac¸on.

Pour un g`ene j, la longueur, suppos´ee connue, est not´ee Lj. Elle s’exprime en nombre de paires de base. La m´ethode de normalisation la plus simple consiste alors `a diviser chaque comptage par la longueur du g`ene correspondant. Cette mesure ne prend cependant pas en compte la profondeur de s´equenc¸age. Pour cela, il faut opter pour la normalisation RPKM2

[155] : RPKM(xij) = xij (Lj 103)( Ni 106)

Cette m´ethode de normalisation ne doit pas ˆetre utilis´ee lorsque l’objectif de l’analyse statistique est de rechercher des g`enes diff´erentiellement exprim´es. Cette m´ethode permet certes d’obtenir des niveaux d’expression comparables entre g`enes mais elle affecte la

variabilit´e [159] et augmente le nombre de faux positifs dans l’analyse diff´erentielle [67].

Concept du nombre total dereads effectifs

Le comptage total de reads d´epend fortement d’un petit nombre de g`enes fortement exprim´es. De plus, la plupart des g`enes ne sont pas diff´erentiellement exprim´es. Il est donc important de prendre en compte cette hypoth`ese dans la m´ethode de normalisation. C’est dans ce contexte que les m´ethodes de normalisations bas´ees sur le concept du nombre

total de reads effectifsont ´et´e d´evelopp´ees. Deux m´ethodes sont g´en´eralement utilis´ees

pour prendre en compte ce concept : la m´ethode RLE3_{et la m´ethode TMM}4_.

La m´ethode RLE [10] est disponible dans le packageDESeq2. Les ´etapes pour obtenir le facteur d’´echelle sj sont les suivantes :

— un pseudo-´echantillon, servant d’´echantillon de r´ef´erence, est cr´e´e pour lequel l’expres- sion du g`ene j, Rj est d´efinie comme la moyenne g´eom´etrique de l’expression de ce g`ene dans tous les ´echantillons :

Rj= (Πni=1xij) 1

n_.

La moyenne g´eom´etrique est utilis´ee car elle est moins sensible aux valeurs extrˆemes que la moyenne standard ;

— les comptages de tous les ´echantillons sont alors compar´es `a ceux de cet ´echantillon de r´ef´erence : ˜xij =

xij

Rj ;

— le facteur d’´echelle est ensuite calcul´e comme :

si= ˜ si exp(1 n Pn l=1log ˜sl) avec s˜i=medianj(˜xij) .

La m´ethode TMM [175] est disponible dans le packageedgeR. Cette m´ethode consiste `

a supprimer les valeurs extrˆemes pour le log Fold-Change (M) et l’intensit´e moyenne en log (A) : Mj(i, i0) = log2  xij Ni  − log2  xi0_j Ni0  et Aj(i, i0) = 1 2  log2  xij Ni  + log2  xi0_j Ni0  .

Pour la m´ethode RLE, un ´echantillon de r´ef´erence est choisi parmi les ´echantillons disponibles

i = 1, . . . , n. Ce choix n’a pas de cons´equence sur la suite de la m´ethode de normalisation mais g´en´eralement, l’´echantillon i0_{, dont le troisi`eme quartile est le plus proche de la}

moyenne des troisi`emes quartiles, est s´electionn´e comme ´echantillon de r´ef´erence.

Apr`es avoir filtr´e les donn´ees en supprimant les g`enes avec des comptages nuls, les donn´ees sont filtr´ees en supprimant les valeurs les plus extrˆemes. Ainsi, 30% des valeurs les plus extrˆemes de M sont supprim´ees et 5% pour les valeurs de A. La moyenne pond´er´ee des valeurs de M est alors calcul´ee avec les ´echantillons restants :

TMM(i, i0) = P j∈G∗w(i, i 0_)M j(i, i0) P j∈G∗wj(i, i0)

3. Relative Log Expression 4. Trimmed Mean of M-values

avec G∗_{l’ensemble des g`enes qui n’ont pas ´et´e supprim´es et} wj(i, i0) =  Ni− xij Nixij +Ni0− xi0j Ni0x_i0_j  .

Le facteur d’´echelle est alors d´efini par :

si= ˜ si exp 1_nPn l=1log(˜sl)
avec ˜si = 2 TMM(i,i0₎ .

[67] ont compar´e les diff´erentes m´ethodes de normalisation dans le cadre d’une analyse diff´erentielle. Ils mettent en ´evidence l’impact de la m´ethode de normalisation sur les r´esultats de l’analyse et formulent des recommandations pour le choix d’une m´ethode de normalisation appropri´ee en conseillant d’utiliser pr´ef´erentiellement RLE ou TMM.