I NFLUENCE DE H N ANOS 1 SUR LES PROPRIETES TUMORIGENES ET INVASIVES IN VIVO

Afin de compléter nos données obtenues in vitro, nous avons testé le rôle potentiel de hNanos1 in vivo dans la formation de tumeur et la dissémination métastatique par des injections ectopiques des cellules DLD1-Teton-mock/hNanos1 traitées ou non à la doxycycline dans les flancs de souris Nude.

L’analyse du volume des tumeurs générées en souris Nude agées de 6 semaines après l’injection montre que les tumeurs générées par les cellules DLD1-Teton-hNanos1 dont l’expression de hNanos1 est induite par le traitement à la doxycycline présentent un volume significativement inférieur (médiane: 618 mm³) aux tumeurs générées par les cellules DLD1-Teton-hNanos1 non traitées (médiane: 1515 mm³) (p<0,001). Dans le même temps, les

volumes des tumeurs générées par les cellules DLD1-Teton-mock avec ou sans traitement à la doxycycline sont équivalents et ne témoignent pas d’un effet de la doxycycline (Figure 27).

Figure 27: Effet de hNanos1 sur le potentiel tumorigène des cellules DLD1 en souris Nude.

A. Graphique comparant les volumes des tumeurs observées à six semaines après injection. B. Tableau présentant le bilan statistique du volume des tumeurs obtenues pour chaque groupe de souris injectées.

Ces données indiquent que l’expression de hNanos1 ne favorise pas la formation des tumeurs primaires aux sites d’injection. Au contraire, on assiste à un effet négatif de l’expression de hNanos1 sur le volume de la tumeur primaire.

Les autopsies réalisées sur les souris ont permis d’analyser la présence ou non de foyers tumoraux secondaires dans différents organes tels que le foie, la rate, les poumons et les reins.

Les données obtenues (tableau 10) démontrent que la présence de métastases péritonéales est plus fréquente chez les souris ayant subi l’injection des cellules DLD1-Teton-hNanos1 traitées à la doxycycline et exprimant hNanos1 (46,15 %) plutôt que l’injection de ces mêmes cellules

non traitées (16,66 %) (p=0,091). La formation de métastases chez les souris injectées avec les cellules contrôles DLD1-Teton-mock avec ou sans traitement de doxycycline est presque identique dans les deux groupes de souris (25% contre 22,22%). Ces foyers tumoraux secondaires observés ont la forme de petites masses disséminées dans le tissu conjonctif péritonéal et de façon préférentielle au niveau du mésentère. Ces observations sont similaires aux constatations cliniques décrites dans le cadre de cancers colorectaux humains. Par ailleurs, aucune autre métastase n’a pu être détectée visuellement dans les différents organes prélevés.

Tableau 10: Effet de hNanos1 sur la production de métastases par les cellules DLD1.

Le pourcentage indique le nombre de souris présentant des métastases péritonéales rapporté au nombre total de souris autopsiées. Probabilité p calculée par test Khi².

Les tumeurs primaires ainsi que les différents organes pouvant présenter des métastases ont été prélevés afin d’être soumis à une analyse histologique. L’analyse des tumeurs primaires révèle la structure glandulaire caractéristique d’un adénocarcinome de colon dont sont issues les cellules DLD1 (Figure 28 A et B). Les cellules DLD1-Teton-hNanos1 traitées à la doxycycline présentent toutefois un aspect plus fusiforme. L’analyse des métastases péritonéales découvertes montre que les cellules tumorales forment des petits massifs cerclés d’une couche épaisse de mésothélium (Figure 28 C). Nous distinguons également que des cellules tumorales peuvent envahir des ganglions lymphatiques comme l’indique la figure 28 D. L’examen des coupes a permis de confirmer l’absence de métastases ou de micro-métastases au sein des organes prélevés.

Figure 28: Histologie des tumeurs primaires et secondaires formées par les cellules DLD1 en souris Nude après coloration HPS.

A. Tumeur primaire sous-cutanée observée six semaines après injection des cellules DLD1-Teton-hNanos1 - dox. Barre d’échelle: 32 µm. B. Tumeur primaire sous-cutanée observée six semaines après injection des cellules DLD1-Teton-hNanos1 + dox. Barre d’échelle: 32 µm. C. Métastase péritonéale observée dans le mésentère. Les flèches indiquent une fibrose stromale en périphérie. Barre d’échelle: 64 µm. D. Métastase péritonéale (M) dans un nodule lymphatique (L) présent dans le mésentère. Barre d’échelle: 128 µm. (Grossissement original: 5x (D), 10x (C) et 20x (A et B)).

Ces données obtenues in vivo en souris Nude confirment que l’expression de hNanos1 favorise le phénomène d’invasion tumorale qui potentialise la dissémination métastatique des cellules tumorales.

C.2.6 INFLUENCE DE HNANOS1 SUR L’EXPRESSION DES MOLECULES D’ADHERENCE INTERCELLULAIRE PAR LES CELLULES DLD1:

C.2.6.1 Influence de hNanos1 sur le taux d’expression des molécules d’ahérence intercellulaire:

Dans le but de déterminer si l’induction de propriétés de dispersion et d’invasion par hNanos1 s’accompagne d’une modification de l’expression des molécules d’adhérence

intercellulaire des cellules DLD1, une analyse du taux de cadhérine-E, caténine p120 et caténine-β a été réalisée par Western blot. L’analyse des extraits protéiques des cellules DLD1-Teton-mock et DLD1-Teton-hNanos1 non traitées ou traitées à la doxycyline ne montre aucune variation significative de l’expression de la cadhérine-E, la caténine-β ou de la caténine p120 (Figure 29).

Figure 29: Analyse par western blotting du taux protéique des molécules d’adhérence intercellulaire.

L’induction de l’expression de hNanos1, mise en évidence par un anticorps dirigé contre myc, ne modifie pas les taux protéiques des molécules d’adhérence cadhérine-E, caténine-β et p120. La quantité de protéines déposée a été contrôlée par immunoblot de la GAPDH.

C.2.6.2 Influence de hNanos1 sur la localisation des molécules d’adhérence intercellulaire:

L’étude de l’influence de hNanos1 sur la localisation des molécules d’adhérence intercellulaire a été réalisée par immunocytochimie. L’analyse immunocytochimique confirme la présence de la protéine de fusion Myc-hNanos1 sous la forme de «points» cytoplasmiques avec une forte concentration périnucléaire uniquement dans les cellules DLD1-Teton-hNanos1 traitées à la doxycycline. En ce qui concerne les molécules d’adhérence, la cadhérine-E, la caténine-β et la caténine p120, elles sont localisées préférentiellement au niveau membranaire des cellules DLD1-Teton-mock non traitées et traitées à la doxycycline ainsi que des cellules DLD1-Teton-hNanos1 non traitées. Lorsque l’expression de hNanos1 est induite, on note une diminution importante du signal au niveau membranaire et l’apparition d’un marquage cytoplasmique plus intense notamment en ce qui concerne la caténine p120. Au niveau nucléaire, aucun marquage n’a pu être observé de manière significative pour ces molécules (Figure 30).

Figure 30: Analyse par immunocytochimie de la localisation des molécules d’adhérence intercellulaire:

L’induction de l’expression de myc-hNanos1 induit une redistribution des molécules d’adhérence cadhérine-E, caténine-β et p120 de la membrane vers le cytoplasme des cellules. Les noyaux des cellules sont marqués au dapi (bleu). Les différents antigènes apparaissent en rouge.

C.2.6.3 Influence de hNanos1 sur l’activité co-transcriptionnelle de la caténine-β:

L’expression de hNanos1 induisant la redistribution de la caténine-β de la membrane cellulaire vers le cytoplasme, l’activité co-transcriptionnelle de la caténine-β dans les cellules DLD1 a donc été mesurée. Un test rapporteur de l’activité de la caténine-β nucléaire montre que l’expression de hNanos1 réduit significativement l’activité de la caténine-β nucléaire dans les cellules Teton-hNanos1, alors que le traitement à la doxycycline des cellules DLD1-Teton-mock ne modifie pas cette activité (Figure 31).

Figure 31:Analyse de l’activité co-transcriptionnelle de la caténine-β dans les cellules DLD1.

L’activité co-transcriptionnelle de la caténine-β est évaluée en transfectant le plasmide rapporteur de l’activité caténine-β/Tcf TOP-FLASH. Les données sont exprimées en unité lumineuse relative. ** p<0,01.

Ces données indiquent donc que la surexpression de hNanos1 perturbe la fonctionnalité des complexes d’adhérence cadhérine-E/caténines en induisant une redistribution des molécules d’adhérence du compartiment membranaire vers le compartiment cytoplasmique et une diminution de l’activité co-transcriptionnelle de la caténine-β.

C.2.7 INFLUENCE DE HNANOS1 SUR LA PRODUCTION DE MMPS PAR LES CELLULES