NanoLC-nanoESI-Qh-FT-ICR

Les principes de la chromatographie liquide et de la source d’ionisation nano-électrospray ayant été expliqués auparavant, seul le principe de fonctionnement de l’analyseur de ce spectromètre de masse sera décrit.

L’utilisation de la résonance d’ions cyclotronique (ICR pour Ion Cyclotron Resonance) avec la spectrométrie a été développée par Sommer en 1949 ⁷⁷ mais c’est seulement dans les années 1980 que la spectrométrie de masse à transformée de Fourier a été décrite par

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Comisarow et Marshall ^{17, 78, 79}. Cette technique a montré de très grandes capacités en termes de résolution et de précision de masse et est à présent incontournable dans le domaine de l’analyse protéomique. Le principe de détection des ions est basé sur la mesure de la fréquence de rotation des ions dans un champ magnétique intense. Il peut être décrit dans le cas d’une cellule cubique constituée de six plaques où chaque paire de plaques parallèles tient un rôle distinct : piégeage, excitation et détection (figure 1-10). Cependant différents types de cellules ont été développées comme la cellule cylindrique fermée, la cellule cylindrique ouverte ou encore la double cellule cubique ⁸⁰, l’objectif commun à ces différents types de cellules étant de concilier les impératifs de piégeage avec ceux de l’excitation et de la détection.

Figure 1-10: Schéma d’une cellule ICR cubique (Source : http://www.techniques-ingenieur.fr/)

Une particule chargée q ayant une vitesse v dans un champ magnétique uniforme B est animée d’un mouvement de rotation appelé mouvement cyclotronique. Ce mouvement résulte de l’action opposée de la force de Lorentz définie par l’équation       et la force centrifuge

où m est la masse de l’ion, r le rayon de la trajectoire qu’il décrit. La vitesse angulaire de l’ion étant définie par  

  .

Ainsi, l’ion a une trajectoire circulaire résultant de l’équilibre de ces deux forces permettant de déterminer la fréquence de rotation cyclotronique :

D’où

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Il résulte de cette équation que la fréquence cyclotronique ne dépend que du champ magnétique et du rapport m/z de l’ion. Cependant, cette mesure ne peut pas être effectuée juste après le piégeage dans la cellule. Avant de procéder à leur détection, il est nécessaire de mettre en phase tous les ions de même rapport m/z par résonance cyclotronique. Cela consiste à appliquer, entre les plaques d’excitation, une différence de potentiel alternative de fréquence précisément égale à la fréquence cyclotronique des ions considérés. Sous l’effet de ce champ électrique alternatif, les ions sont accélérés et le rayon de leur trajectoire est accru. Durant cette phase d’excitation, tous les ions de même m/z sont mis en phase sur des orbites circulaires de dimensions croissantes. L’excitation est stoppée avant que le diamètre de l’orbite n’excède les dimensions intérieures de la cellule. Il a été démontré que lors de l'excitation d’un ion à sa fréquence cyclotronique avec une tension V0 appliquée pendant une durée Texc, le rayon de l’orbite est donné par l’équation ^{0 exc}

0 où r est le rayon cyclotron, V0 la tension appliquée, Texc le temps d’excitation et B0 le champ magnétique ⁸¹. Le rayon cyclotron des ions ne dépend donc que de la tension appliquée et du temps de l’excitation et pas du rapport m/z. Aussi le contrôle de ces deux paramètres permet d’amener les ions à un rayon optimal de manière à les faire passer près des plaques de détection pour une mesure sensible sans distorsion du signal. La rotation cohérente des ions à large rayon crée un courant miroir sur les plaques de détection par interaction électrostatique entre les ions et les électrons du métal. Le signal transitoire observé pour des ions de même rapport m/z est une sinusoïde amortie exponentiellement. Ce signal amorti est dû à divers facteurs dont les collisions ion-molécule et la répulsion coulombienne ⁸², qui détruisent la cohérence du paquet d'ions, qui finit par avoir une distribution radiale homogène et ne plus induire de courant dans les plaques de détection. Dans le cas où un ensemble d’ions de rapports m/z différents sont détectés, le signal correspond à la superposition des courants induits pour chaque rapport m/z. La transformée de Fourier permet de transformer ce signal en un spectre de fréquences cyclotroniques, lui-même converti en un spectre de masse.

Il existe deux modes principaux de transport des ions entre la source d'ions et la cellule ICR : les multipôles et les guides électrostatiques. Concernant les multipôles, ce sont généralement des hexapôles ou des octopôles qui sont utilisés. La fréquence et l'intensité de la tension radiofréquence appliquée aux électrodes des multipôles sont réglées afin de transmettre tous les ions suivant l'axe z. Pour les guides électrostatiques, un système de lentilles électrostatiques assure l'accélération, la focalisation puis la décélération des ions pour les transporter de la source à la cellule. Les instruments actuels sont basés soit sur du transport

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multipolaire soit sur un guide électrostatique, avec un hexapôle de stockage en aval de la source d'ionisation, ce qui permet d'optimiser la sensibilité de l'appareil.

La résolution est liée au champ magnétique et au rapport m/z d’après la relation : 2

où cste est une constante d’amortissement du signal qui est inversement proportionnelle à la pression. La résolution de l'appareil augmente avec l'intensité du champ magnétique et diminue avec la pression dans la cellule ICR. Dans tous les cas, étant donné la durée limitée de la mesure du signal, la résolution augmente avec la fréquence cyclotron, ce qui implique qu'elle diminue avec le rapport m/z des ions. La précision en masse dépend de la résolution mais également de la qualité de la calibration de l'appareil ⁸³. Une calibration interne permet d’atteindre une précision de l'ordre de 1-2 ppm sur une gamme de masse de 500 à 1500. Ainsi, les spectromètres de masse FT-ICR font partie des appareils qui offrent les meilleurs pouvoirs de résolution et de précision de masse et permettent la détermination des structures primaires et secondaires des protéines par analyse MS et MS/MS, ainsi que de leur conformation par étude d'échanges H/D ⁸⁴.

Figure 1-11: Schéma interne du spectromètre de masse FT-ICR Bruker Daltonics 9,4 T

3.2. La protéomique

3.2.1. Définition

Le terme protéome, construit par analogie avec le terme génome, est apparu dans la littérature scientifique en 1995 ⁸⁵. Le protéome est défini comme étant l’ensemble des

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protéines présentes dans un échantillon biologique donné (liquide physiologique, tissus, organes…) dans une situation physiologique ou pathologique donnée. Le protéome résulte de la traduction du génome en protéines par l’ARN messager dans des conditions de vie définies. Un seul génome peut donc conduire à différents protéomes en fonction des étapes du cycle cellulaire, de la différenciation, de la réponse à différents signaux biologiques ou physiques, de l'état physiopathologique... Alors que le génome d’une cellule est constant, le protéome reflète les répercussions de ces événements cellulaires, il est de nature dynamique ⁸⁶. Par ailleurs, une protéine peut être modifiée chimiquement après sa synthèse ou au cours de sa vie dans la cellule. Le plus souvent ces modifications sont induites par une enzyme mais il existe également des modifications qui ne sont pas induites de manière enzymatique et qui apparaissent après exposition à des facteurs extérieurs (exposition aux UV…). Cela augmente la complexité du protéome et montre que seule son étude permet la compréhension globale d’un système biologique donné dans une situation déterminée. La protéomique désigne donc la science qui étudie les protéomes. Cette science s’est fortement développée ces dernières années grâce, d’une part, à l’augmentation exponentielle des séquences de génomes disponibles et, d’autre part aux progrès de la spectrométrie de masse. La démarche classique de l’analyse protéomique se divise en plusieurs étapes et consiste, dans un premier temps, à extraire les protéines du milieu d’étude (fluide biologique, cellule, plante…). Ensuite, l’analyse des protéines peut être effectuée selon deux stratégies différentes appelées ‘top-down’ et ‘bottom-up’ ^87-90 (voir figure 1-12). La stratégie dite ‘top down’ permet l’analyse de protéines sans hydrolyse chimique ou enzymatique au préalable. Dans ce cas les protéines sont fragmentées directement dans le spectromètre de masse (dans la source ou dans l’analyseur selon l’appareil utilisé). Cette approche n’ayant pas été utilisée dans ces travaux de thèse, nous n’en détaillerons pas le principe.

Figure 1-12: Représentation schématique des stratégies d’analyse protéomique ‘top-down’ et ‘bottom-up’ (issue de la publication de Chait 90)

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