Caractérisation par micro-Raman

3.2.1.1. Spectre de la protéine native

Le spectre Raman du lysozyme commercial utilisé dans la formulation des peintures modèles se caractérise par la présence de plusieurs bandes intenses (voir figure 2-7) dont la bande attribuée aux liaisons S-S caractérisant les ponts disulfures, les bandes attribuées aux acides aminés tryptophanes (760, 1011, 1550 cm^-1) et phénylalanines (1003 cm^-1),les bandes dues aux déformations des groupements CH (1450 cm^-1) et CH2 (1340 cm^-1) des chaines latérales et les bandes dites amide I (1660 cm^-1) et amide III (1250 cm^-1).

Figure 2-7: Spectre micro-Raman (λ=632,8 nm) du lysozyme commercial

Le spectre du lysozyme se caractérise également par la présence de bandes entre 2800 et 3100 cm^-1 dues à l’élongation des groupements CH3, CH2 et CH aliphatiques et aromatiques.

3.2.1.2. Détermination de la structure secondaire du lysozyme par

décomposition de la bande amide I

3.2.1.2.1. Structure secondaire d’une protéine : définition

La structure primaire d’une protéine correspond à la succession linéaire des acides aminés la constituant sans référence à une structure spatiale. La structure secondaire se

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rapporte à la description de la structure tridimensionnelle localement adoptée par certains segments de molécules biologiques (protéines, ADN, ARN).

En ce qui concerne les protéines, la structure secondaire est définie par des arrangements de liaisons hydrogènes entre les groupements -NH et -CO du squelette peptidique. Les structures secondaires les plus courantes sont les hélices α et les feuillets β (voir figure 2-8). L'hélice α est une structure périodique très fréquente dans le repliement des protéines et des peptides. Elle se caractérise par la formation de liaisons hydrogènes entre le groupement -CO d'un résidu i et le groupement -NH d'un résidu i+4. D'autres types d'hélices, comme les hélices 310 et les hélices π sont prédites comme ayant des arrangements favorables de liaisons hydrogènes, mais ne sont observées que de manière exceptionnelle dans les protéines naturelles, sauf à l'extrémité des hélices α. Le brin β est une structure périodique étendue. Les liaisons hydrogènes qui le stabilisent se font entre résidus distants plutôt qu'entre résidus consécutifs, comme dans le cas de l'hélice α. En fait, un brin β seul n'est pas stable. Il a besoin de former des liaisons hydrogènes avec d'autres brins β pour se stabiliser. On parle alors de feuillets β. Les feuillets β ne sont pas plans, ils présentent un plissement sur leur surface, avec des plis alternativement orientés vers le haut et vers le bas. Les résidus acides aminés sont placés face à face dans deux chaînes qui peuvent se déployer, soit en sens contraire (feuillet β antiparallèle), soit dans le même sens (feuillet β parallèle) comme montré sur la figure 2-8. Des coudes (β turn), régions où le squelette change brutalement de direction, et des régions flexibles et irrégulières connectent entre eux les éléments réguliers que sont les hélices et les feuillets. La pelote aléatoire n'est pas à proprement parler une structure secondaire, mais plutôt une catégorie par défaut, dans laquelle on classe les conformations qui ne correspondent pas à une structure secondaire régulière.

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3.2.1.2.2. Structure secondaire du lysozyme

La chaine principale du lysozyme est constituée de 129 acides aminés. Le domaine α de la protéine est composé de quatre hélices (trois hélices α et une hélice 310) alors que le domaine β est constitué d’un feuillet anti-parallèle et d’une boucle ⁴⁵. Le spectre Raman dans la région caractéristique de la bande dite amide I présente plusieurs bandes principales (voir figure 2-9). La bande dite amide I (~ 1660 cm^-1) est une bande complexe qui peut être décomposée en plusieurs composantes ^46-54, chaque composante étant représentative d’un type de conformère comme cela a été expliqué dans le chapitre précédent.

Figure 2-9: Spectre micro-Raman (λ = 632,8 nm) du lysozyme enregistré entre 1500 et 1800 cm-1(4 accumulations de 15 minutes)

Nous avons donc étudié la structure secondaire du lysozyme à l’état natif en utilisant la décomposition de la bande amide I. Nous remarquons que cette bande est précédée de 4 bandes (figure 2-9). Les deux bandes à 1605 et 1619 cm^-1 attribuées respectivement aux acides aminés phénylalanines et tyrosines n’étant pas bien séparées de la bande amide I, elles ont été prises en compte lors de la décomposition spectrale.

La bande amide I a été décomposée en utilisant le logiciel Labspec, propre aux spectromètres commercialisés par la société Horiba Jobin-Yvon. La décomposition est basée sur trois critères : la position des composantes, leur profil et leur largeur. Le nombre de composantes doit être maintenu au minimum sachant que l’existence d’une bande nécessite un sens d’un point de vue structural. Dans cette étude, le profil que nous avons utilisé pour chaque composante est un mélange Gaussien/Lorentzien (avec une contribution Lorentzienne ≥ 50%) et nous avons fixé une largeur à mi-hauteur de 25 cm^-1 au maximum.

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Figure 2-10: Décomposition de la bande amide I du lysozyme natif

La bande amide I du spectre expérimental (représenté en pointillés sur la figure 2-10) est donc décomposée en 5 bandes dont la position, la largeur à mi-hauteur et l’aire sont récapitulées dans la table 2-3 présentée ci-dessous. Dans les années 1980, plusieurs groupes de recherche ont proposé une décomposition de la bande amide I basée sur 3 structures : hélices α, feuillets β et structure dite indéfinie qui regroupe les coudes et les régions en pelote statistique. Dans ce travail, nous avons décidé d’inclure une composante attribuée aux coudes, qui sont également des structures ordonnées, comme cela a été suggéré récemment par Vass et al ⁵⁵. Suivant ce modèle, la conformation en hélice α est caractérisée par une composante à 1651,4 cm^-1,les bandes à 1635,2 et 1665,5 cm^-1 sont attribuées aux conformères de type β alors que celle à 1679,3 cm-1 est attribuée aux coudes et enfin la composante à 1693,9 cm-1

correspond à la structure désordonnée de la protéine. L’aire de chaque composante est reliée à la proportion de chaque conformère présent dans la protéine et permet de quantifier les différentes conformations.

Raman shift, cm^{-1 Largeur à mi-}_{hauteur, cm}-1 Aire Conformation ^{Pourcentage de} _conformère

1635,2 9,70 19619,5 Brin β 2,03

1651,4 22,19 392706 Hélices α 40,67

1665,5 18,45 204633 Feuillets β 21,19

1679,3 20,58 202497 Coudes 20,97

1693,9 22,15 146062 Structure désordonnée 15,13

Table 2-3: Caractéristiques des composantes issues de la décomposition de la bande amide I du lysozyme natif 6 5 0 0 7 0 0 0 7 5 0 0 8 0 0 0 8 5 0 0 9 0 0 0 9 5 0 0 1 0 0 0 0 1 0 5 0 0 1 1 0 0 0 1 1 5 0 0 1 2 0 0 0 1 2 5 0 0 1 3 0 0 0 1 3 5 0 0 1 4 0 0 0 1 4 5 0 0 1 5 0 0 0 1 5 5 0 0 1 6 0 0 0 I n t e n s i t y , c o u n t s 1 6 0 0 1 6 2 0 1 6 4 0 1 6 6 0 1 6 8 0 1 7 0 0 1 7 2 0 1 7 4 0 R a m a n s h i f t , c m- 1 1635. 1604. 1618. 1651. 1665. 1679. 1693.

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Les données obtenues nous permettent d’estimer la structure secondaire du lysozyme que nous avons utilisé. Nous obtenons donc ~41% d’hélices α, ~23% de conformères de type β, ~21% de coudes et 15% de régions en pelote statistique, ce qui est en accord avec les résultats présentés précédemment dans la littérature qui reportent entre 39 et 46 % d’hélices, entre 19 et 25% de conformères β et entre 32 et 41% de structures dites indéfinies ^{49, 51, 56}.