ET D’APPRENTISSAGE DE L’ENCADREMENT SCIENTIFIQUE
1. DE LA MUTATION PATCHWORK A LA VOIE NOTCH : LES MUTATIONS AFFECTANT LES CELLULES SOUCHES DE MELANOCYTES
1.2. ROLE DE LA VOIE NOTCH DANS LE DEVELOPPEMENT ET LA BIOLOGIE DU LIGNAGE MELANOCYTAIRE
1.2.4. Des mutations dans Strawberry Notch 2 et Notchless, deux potentiels gènes modificateurs de la voie Notch, conduisent à un blanchiment
37
postérieurs, certainement liée à une fuite de du promoteur Tyrosinase dans les nerfs périphériques. Ce phénotype les empêche de se reproduire. Les schémas de croisement pour entretenir cette lignée sont assez complexes et ne génèrent que très peu d’individus mutants.
En conclusion, la suractivation de la voie Notch dans le lignage mélanocytaire affecte le développement embryonnaire, mais n’a pas d’effet notable en période postnatale sur le lignage mélanocytaire, en particulier sur les cellules souches des mélanocytes.
1.2.4. Des mutations dans Strawberry Notch 2 et Notchless, deux potentiels gènes modificateurs de la voie Notch, conduisent à un blanchiment accéléré du pelage.
Il existe peu de mutations associées à un blanchiment accéléré du pelage. Les seules rapportées dans la littératures sont des mutations dans les gènes Bcl2, Mitf, Atr et dans trois gènes de la voie de signalisation Notch : Rbp-Jκ, Notch1 et Notch2 5, 17, 18, 20-‐23. Il est frappant que la moitié des mutations rapportées affecte des gènes de la voie Notch. Cette voie semble centrale dans le contrôle de l’homéostasie des cellules souches. Il s’agit d’une voie finement régulée par un ensemble de gènes modificateurs. Des mutations dans des gènes modificateurs de la voie Notch pourraient également entraîner un blanchiment de la couleur du pelage.
Nous testons cette hypothèse en étudiant l’effet de mutations dans deux gènes potentiellement modificateurs de la voie Notch : Strawberry Notch homolog 2 (Sbno2) et
Notchless (Nle).
La première mutation est le gain de fonction de Sbno2 dans le lignage mélanocytaire présenté précédemment (Tg(Dct::Sbno2)). L’analyse du phénotype de cette souris est en cours et a constitué une partie du stage de Master 2 de Cyrine Rammah (2008-‐2009).
La deuxième mutation est une perte de fonction conditionnelle de Notchless dans le lignage mélanocytaire (cNle KO). Elle a été obtenue en croisant des souris porteuses du transgène Tyr::Cre avec des souris porteuses d’un allèle floxé de Nle 15, 24. La souris porteuse de l’allèle floxé de Nle a été produite par Sarah Cormier dans le Laboratoire de Génétique Fonctionnelle de la Souris à l’Institut Pasteur et l’analyse du phénotype des souris cNle KO se fait en collaboration avec Sarah et Michel Cohen-‐Tanoudji.
Le gain de fonction de Strawberry Notch homolog 2 dans le lignage mélanocytaire s’accompagne d’un blanchiment du pelage.
Les souris transgéniques Tg(Dct::Sbno2) ont été générées par injection d’œufs F1(C57BL/6J x CBA) x F1(C57BL/6J x CBA), et transférés dans des femelles F1(C57BL/6J x CBA). Initialement, les souriceaux transgéniques naissaient avec le phénotype de dépigmentation du pelage semblable à patchwork, et blanchissaient légèrement avec l’âge. Nous avons établi une lignée congénique C57BL/6J-‐
Tg(Dct::Sbno2). Au fur et à mesure des croisements en retour sur le fonds C57BL/6J, le
phénotype des nouveaux-‐nés Tg(Dct::Sbno2) s’est modifié : chez les souris congéniques C57BL/6J-‐Tg(Dct::Sbno2), le premier pelage des souriceaux est noir avec, éventuellement, une ou plusieurs taches blanches sur le dos ; il comporte une grande tache blanche sur le ventre ; le bout des pattes et de la queue est blanc (Figure 8). Ce phénotype est caractéristique des mutations qui affectent le développement embryonnaire du lignage mélanocytaire : les zones de fin de migration des mélanoblastes, à savoir le ventre, le bout des pattes et de la queue, sont blancs.
Geneviève Aubin-Houzelstein Rapport Demande HDR Document d’évolution scientifique 38
Figure 8 : Phénotype de pelage de souriceaux congéniques C57BL/6J-
Tg(Dct::Sbno2) âgés de dix jours. Tg = Tg(Dct::Sbno2)
A partir de 3 à 4 mois d’âge, le pelage blanchit fortement. Mais les souris
Tg(Dct::Sbno2) âgées ne sont jamais aussi blanches que les souris cRbpJ KO (Figure 9).
Le blanchiment accéléré des souris congéniques C57BL/6J Tg(Dct::Sbno2) ne s’accompagne pas de la production de poils gris, contrairement à celui des souris cRbpJ KO.
Figure 9 : Comparaison de la cinétique de blanchiment du pelage des souris surexprimant Strawberry Notch homolog 2 (Tg(Dct::Sbno2)) et invalidées pour la voie Notch (cRBPJ KO) dans le lignage mélanocytaire. T, t : témoins des souris
Tg(Dct::Sbno2) et cRBPJ KO respectivement. Etoile noire : souris de 10 mois ; étoile
blanche : souris de 4 mois.
Geneviève Aubin-Houzelstein Rapport Demande HDR Document d’évolution scientifique
39
Analyse de la distribution des cellules du lignage mélanocytaire dans les follicules pileux de souris congéniques Tg(Dct::Sbno2)
Pour tester si la surexpression de Sbno2 dans le lignage mélanocytaire s’accompagne d’une disparition des cellules souches de mélanocytes, nous étudions la distribution des cellules Dct::lacZ positives dans les follicules pileux de doubles transgéniques Tg(Dct::Sbno2)/° ; Tg(Dct::lacZ)/°. Chez les souris Tg(Dct::Sbno2)/° ;
Tg(Dct::lacZ), la surexpression de Sbno2 sous le contrôle du promoteur Dct conduit à un
phénotype singulier : l’expression du rapporteur lacZ dans de grosses cellules dendritiques, formant un réseau autour des bulges des follicules pileux. (Figure 10). Comme elles sont présentes dans les follicules pileux des souris doubles transgéniques en télogène, il est peu probable qu’il s’agisse de cellules du lignage mélanocytaire. En effet, les progéniteurs de mélanocytes et les mélanocytes différenciés meurent pendant le catagène ; pendant le télogène, seules les cellules souches, situées dans le bulge, restent présentent.
Figure 10 : Distribution des cellules du lignage mélanocytaire dans des follicules
pileux isolés de peaux C57BL/6J-Tg(Dct::Sbno2)/° ; Tg(Dct::lacZ) aux premier (J10)
et deuxième (J30) cycle de croissance du poil. § : position du bulge. * : réseau de cellules dendritiques autour du bulge.
Chez les doubles transgéniques, la partie transitoire haute du follicule pileux, allant du bulge au bulbe, est dépourvue de cellule Dct::lacZ postitive, alors que les témoins en contiennent dans cette région.
La plupart des bulbes des follicules pileux des doubles transgéniques comportent des cellules Dct::lacZ positives pigmentées, et les tiges pilaires correspondantes sont
Geneviève Aubin-Houzelstein Rapport Demande HDR Document d’évolution scientifique
40
noires. Quelques follicules pileux ne contiennent aucune cellule Dct::lacZ positive ; la tige pilaire correspondante est blanche.
Lors du deuxième cycle de croissance du poil, alors que les follicules pileux des souris témoins sont en anagène précoce, ceux des doubles transgéniques
Tg(Dct::Sbno2)/° ; Tg(Dct::lacZ) sont encore en télogène: ils ne comportent que la partie
permanente qui s’arrête au bulge.
Ces résultats suggèrent que la surexpression de Sbno2 sous contrôle du promoteur Dct s’accompagne d’une diminution du nombre de progéniteurs dans la partie transitoire haute, de l’apparition de cellules exprimant Dct autour des bulges des follicules pileux, et d’un retard de développement des follicules pileux lors du deuxième cycle de croissance du poil.
Notchless est essentiel au développement embryonnaire du lignage
mélanocytaire.
Lors du premier cycle de croissance du poil, les souris invalidées pour Notchless dans le lignage mélanocytaire (cNle KO) ont un pelage comportant des zones blanches et des zones de phénotype sauvage, larges et à contours nets (Figure 11A). Les zones blanches sont dépourvues de toute cellule du lignage mélanocytaire. Chez les souris cNle
KO, la recombinase Cre est produite sous le contrôle du promoteur Tyrosinase, à partir
du 10ème jour d’embryogenèse (E10,5) 15. Chez ces souris, les étapes initiales du développement embryonnaire du lignage mélanocytaire se font donc normalement : la détermination des mélanoblastes à partir des cellules des crêtes neurales, la prolifération, la migration et la survie des mélanoblastes sont comparables à celles des souris sauvages jusqu’à E10,5. A la naissance, il existe des zones dépourvues de lignage mélanocytaire. Notchless est donc nécessaire à la survie des mélanoblastes embryonnaires entre E10,5 et la naissance.
Figure 11 : Phénotype de pelage de souris invalidés pour Notchless (cNle KO) dans le lignage mélanocytaire
A : fonds nonagouti ; B-‐C : fonds agouti. Noter le blanchiment du pelage des souris cNle
KO 1 et 2 des figures B et C, montrant les mêmes souris à 4 mois d’intervalle.
Pour préciser le moment où a lieu la mort des mélanoblastes chez les souris cNle
KO, nous suivons la distribution du lignage mélanocytaire chez des embryons cNle KO ; Tg(Dct::lacZ) à l’aide du rapporteur lacZ. A ce jour, nous avons analysé les stades
embryonnaires E11,5 à E14,5. Chez les embryons cNle KO ; Tg(Dct::lacZ), nous avons observé une diminution de la densité de cellules Dct::lacZ positives à partir de E12,5. A E14,5, la densité est très fortement diminuée par rapport aux témoins, mais il existe encore des cellules Dct::lacZ positives tout le long de l’axe antéro-‐postérieur.
Geneviève Aubin-Houzelstein Rapport Demande HDR Document d’évolution scientifique
41
Chez les souris cNle KO, les zones pigmentées peuvent avoir deux origines : soit la délétion de l’allèle Nleflox ne s’est pas faite correctement dans un mélanoblaste précoce et le mélanoblaste non délété donne naissance à un clone de mélanocytes de phénotype sauvage. Soit la délétion de l’allèle Nleflox se fait correctement, et le mélanoblaste délété et sa descendance « échappent » à la mort associée à l’absence de protéine Notchless. Pour tester ces hypothèses, nous avons arraché des poils de zones pigmentées de souris
cNle KO, nous avons extrait l’ADN de leurs bulbes puis réalisé des PCR permettant de
distinguer l’allèle floxé de l’allèle délété de Notchless. Dans la majorité des cas, nous avons mis en évidence uniquement l’allèle délété de Notchless dans les ADN de mélanocytes issus des taches pigmentées. Il faut donc admettre que la délétion de
Notchless dans un mélanoblaste précoce puisse ne pas toujours avoir de conséquence
phénotypique.
Chez les souris invalidées pour Notchless dans le lignage mélanocytaire, les taches pigmentées blanchissent de façon anticipée.
Les zones pigmentées des souris cNle KO pour lesquelles la délétion de l’allèle
Notchless s’est faite blanchissent dès la deuxième pousse du poil (Figure 11, B-‐C). La
cinétique de blanchiment des taches pigmentées des souris cNle KO est comparable à celle des souris cRbp KO : le blanchiment est notable dès la seconde pousse du poil, et les souris deviennent totalement blanches entre 8 et 12 mois.
Ces résultats suggèrent que Notchless et Strawberry Notch homolog 2 sont impliqués dans le contrôle de l’homéostasie des cellules souches de mélanocytes.
1.2.5. Etude de la fonction de Strawberry Notch homolog 2 chez la souris
Etude du profil d’expression de Sbno2
Nous avons cherché à déterminer le profil d’expression de Sbno2 chez la souris. Par hybridation in situ, Nelly Da Silva a trouvé un marquage dans tous les tissus embryonnaires à E7,5. Entre E9 et E11, l’ARNm était retrouvé dans le télencéphale, les arcs branchiaux, les bourgeons de membres (Figure 12). Aux stades embryonnaires plus tardifs et en période postnatale, nous n’avons pas pu obtenir d’hybridation in situ correcte pour Sbno2. Le niveau d’expression du gène est peut-‐être trop faible pour être détecté par cette méthode peu sensible.
Figure 12 : Profil d’expression de Strawberry Notch homolog 2 révélé par hybridation in situ sur des embryons C57BL/6J