ET D’APPRENTISSAGE DE L’ENCADREMENT SCIENTIFIQUE
2. DETERMINISME GENETIQUE DE L’ALLONGEMENT INTESTINAL DES SOURIS PRM/Alf
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Figure 13 : Exemples de phénotypes d’embryons issus des croisements entre hétérozygotes C57BL/6J- Sbno2Gt1
Colonne de gauche : embryons à phénotypes sauvages. Deux colonnes de droite : embryons à phénotypes anormaux. De haut en bas : stades E8,5, E9,5 et E10,5.
2. DETERMINISME GENETIQUE DE L’ALLONGEMENT INTESTINAL DES SOURIS PRM/Alf
L’allongement intestinal des souris PRM/Alf étant propre à cette lignée consanguine, il a une composante génétique. Nous nous sommes intéressés à ce phénotype dans le but d’isoler des molécules impliquées dans le contrôle de la taille de l’intestin.
Sylvain Bellier, maître de conférence dans notre laboratoire, est en charge de l’analyse phénotypique et physiologique du phénotype d’allongement du tube digestif. Pierrick Salaün, technicien dans le laboratoire et moi-‐même nous intéressons au déterminisme génétique du phénotype d’allongement intestinal des souris PRM/Alf. Nelly Da Silva a participé aux étapes initiales du travail lors de son stage de doctorat. Sabrine Hammiche a participé à ce travail pendant son stage de Master 2 (2008) qui a été co-‐encadrée par Sylvain et moi-‐même.
2.1. L’ALLONGEMENT INTESTINAL DES SOURIS PRM/ALF EST UN CARACTERE POLYGENIQUE COMPLEXE.
L’ensemble de ces résultats ont été obtenu au cours des thèses de Nelly Da Silva et de moi-‐même et ont fait l’objet d’une publication 10 et du mémoire de Pierrick Salaün pour l’obtention de son Diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes (2004).
2.1.1. Mode de transmission du phénotype d’allongement intestinal
Le mode de transmission génétique a été déterminé en étudiant la distribution des longueurs intestinales des lignées parentales PRM/Alf et DBA/2J, ainsi que de leur descendance F1 (PRM/Alf x DBA/2J ou DBA/2J x PRM/Alf), F2 (intercross : F1 x F1), et BC1 (croisements en retour sur PRM/Alf (F1 x PRM/Alf ou PRM/Alf x F1) ou sur DBA/2J
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(F1 x DBA/2J ou DBA/2J x F1)) Les courbes gaussiennes obtenues dans les générations F2 et BC1 étaient caractéristiques d’un caractère quantitatif à transmission polygénique. L’allongement intestinal est donc un caractère génétique complexe.
2.1.2. Influence du sens de croisement
L’analyse des distributions de longueur de tube digestif des générations F1 et F2 a permis de constater que la variance des individus F2 n’augmentait pas par rapport à celle des F1. Or, étant donné le brassage génétique chez les F2, la variance des F2 devrait être supérieure à celle des F1. Une hypothèse pour expliquer ces résultats était l’hétérogénéité de la population F1 selon le sens de croisement (PRM/Alf x DBA/2J ou DBA/2J x PRM/Alf).
Pour tester cette hypothèse, les individus F1 ont été séparés en fonction du sens de croisement. Une différence de longueur intestinale a été mise en évidence entre les F1 à mère PRM/Alf et les F1 à mère DBA/2J. Les premiers avaient un intestin significativement plus long que les seconds. Le génome de la mère joue donc un rôle dans le phénotype d’allongement intestinal observé chez les descendants.
2.1.3. Interaction des génomes maternels et zygotiques
Pour s’assurer de l’influence du génome de la mère sur la longueur intestinale des petits, des expériences d’adoptions croisées ont été réalisées. Ces expériences ont montré que :
-‐ un petit PRM/Alf adopté par une mère DBA/2J a un intestin plus court que s’il était élevé par sa mère PRM/Alf : le génome de la mère intervient dans le phénotype d’allongement intestinal.
-‐ un petit PRM/Alf élevé par sa mère PRM/Alf a un intestin plus long qu’un petit DBA/2J adopté par une mère PRM/Alf : le génome du petit intervient dans le phénotype d’allongement intestinal.
-‐ la taille d’intestin maximale est obtenue lorsque la mère allaitante et le petit sont PRM/Alf. Cette taille est supérieure à celle obtenue par l’addition des effets du génome PRM/Alf de la mère et du petit. Donc, dans le phénotype d’allongement intestinal, il existe une interaction positive entre le génome PRM/Alf de la mère et du petit.
En conclusion, l’allongement intestinal est un caractère à déterminisme génétique complexe, où le génome de la mère et du petit interagissent.
2.2. APPROCHE GENES CANDIDATS
2.2.1. Il existe dans la région patchwork un ou plusieurs gènes qui influencent la taille du tube digestif.
La lignée consanguine PRM/Alf a été établie par croisements frère-‐sœur entre souris de génotype pwk/pwk. La seule sélection opérée lors de l’établissement de la lignée s’est faite sur la couleur du pelage. Les souris consanguines PRM/Alf pwk/pwk présentent, outre une dépigmentation du pelage, un allongement du tube digestif. On peut supposer que les deux caractères soient liés.
Pour tester cette hypothèse, Nelly Da Silva et moi-‐même avons voulu établir une lignée congénique 129/Sv pwk/pwk. La pénétrance de la mutation patchwork sur le fonds 129/Sv est bonne. Nous avons comparé la longueur du tube digestif de 41 souris
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souris pwk/pwk avaient un intestin de 61,1±3,7 cm et les souris +pwk/+pwk avaient un intestin de 56,4±2,5 cm. Les souris pwk/pwk avaient un intestin significativement plus long que les souris +pwk/+pwk (test t de Student, p<0,001). Un ou plusieurs loci liés génétiquement au locus patchwork doivent participer au contrôle de la longueur du tube digestif.
2.2.2. La longueur du tube digestif est associée au génotype pour Igf1.
Nous avons testé Igf1 comme gène candidat dans le phénotype d’allongement intestinal des souris PRM/Alf. Nous avons sélectionné Igf1 car la protéine IGF1 intervient dans la croissance intestinale, est présente dans le lait, a son récepteur exprimé dans l’intestin, et qu’il est situé sur le chromosome 10, à proximité de la région patchwork (à 7,7 Mb de Sbno2).
Au cours de son stage de M2, Sabrine Hammiche a recherché un polymorphisme dans Igf1 entre les lignées PRM/Alf et DBA/2J et a génotypé les individus BC1 et F2 que nous avions produits. Elle a montré qu’il existe une association entre le génotype pour
Igf1 et la longueur de l’intestin de souris issues du croisement en retour entre des souris
PRM/Alf et des souris F1 entre les lignées PRM/Alf et DBA/2J. Chez les BC1 de direction opposée et chez les F2, aucune association n’a été trouvée.
Par la même méthode, nous n’avons pas trouvé d’association entre le génotype pour l’Igf1r et la longueur du tube digestif.
Sabrine a dosé la concentration en protéine IGF1 dans le lait et le sang de femelles PRM/Alf et DBA/2J par RIA. Elle a trouvé que la concentration en IGF1 est significativement plus élevée dans le sang de femelles PRM/Alf mais qu’elle est inchangée dans le lait.
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EMEPARTIE: 2009- : LA PERIODE DE GESTION DE PROJETS
1. CONTROLE GENETIQUE DE L’HOMEOSTASIE ET DE LA TUMORIGENESE DES CELLULES SOUCHES DE MELANOCYTES
Ce projet fait l’objet d’un financement de l’Association pour la Recherche contre le Cancer pour les années 2009-‐2010. Je coordonne le projet.
Les personnes du laboratoire participant à ce projet sont : Giorgia Egidy-‐Maskos, CR1 INRA ; Florence Bernex, MC ENVA ; Jean-‐Jacques Panthier, Pr1 ENVA ; Sophia Julé-‐ Loidice, TR INRA ; Stéphanie Gadin, TR INRA ; Cécile Campagne, doctorante ED CdV.
Pour ce projet, nous collaborons avec l’Unité de Génétique Fonctionnelle de la Souris, Institut Pasteur; responsable : Pr Jean-‐Jacques Panthier ; l’Unité de Neurobiologie Intégrative des Systèmes Cholinergiques, Institut Pasteur; responsable : Dr Uwe Maskos ; le groupe Melanocytes et souris transgéniques, Swiss Institute for Medical Cancer Research, Epalinges, Suisse ; responsable : Dr Friedrich Beermann.
1.1. PROBLEMATIQUE, HYPOTHESES ET OBJECTIFS DU PROJET
Les tumeurs sont constituées de populations cellulaires hétérogènes. Alors que la majorité des cellules d’une tumeur exprime des marqueurs de différenciation, l’initiation et la croissance de la tumeur se font à partir d’un nombre restreint de cellules indifférenciées présentant les caractéristiques de cellules souches, notamment la capacité d’auto-‐renouvellement. Ces cellules, capables de former de nouvelles tumeurs après xénotransplantation, sont dénommées cellules initiatrices de tumeur ou cellules souches cancéreuses. Des cellules souches cancéreuses ont été identifiées dans des leucémies, des cancers du poumon, du cerveau, du sein et dans des mélanomes (voir pour revue 26). Le mélanome constitue un problème de santé publique. La présence de métastases est de mauvais pronostic et les traitements contre le mélanome ne sont pas efficaces. Le manque d’efficacité thérapeutique pourrait être lié à un mauvais ciblage cellulaire des traitements, qui visent les cellules en prolifération. Des traitements qui cibleraient spécifiquement les cellules souches cancéreuses pourraient être des compléments thérapeutiques efficaces aux traitements actuels 12. Pour développer de tels traitements, il est nécessaire de disposer de marqueurs de cellules souches cancéreuses afin de les cibler et de les distinguer des cellules souches normales qui doivent être préservées par les traitements. A ce jour, l’origine des cellules souches cancéreuses et leur lien avec les cellules souches normales restent mal connus.
Nous nous proposons d’utiliser le lignage mélanocytaire et le mélanome comme modèles d’étude. Nous testons l’hypothèse selon laquelle des gènes impliqués dans
la biologie des cellules souches de mélanocytes participent au développement du mélanome en agissant sur la population de cellules souches cancéreuses.
Dans ce but, nous utilisons des approches de génétique murine pour:
- étudier la fonction des gènes candidats Strawberry Notch homolog 2, Notchless et