Les exp´eriences pr´esent´ees ont pu ˆetre r´ealis´ees grˆace au financement apport´e par une ATIP Jeunes Chercheurs (2005). Je me suis pour cela investie dans la r´ealisation des exp´erience en acqu´erant les bases de la culture cellulaire.
L’analyse des images a ´et´e l’objet du stage de Master 2 ”Mod`eles et Instruments en M´edecine et Biologie” de Ghizlane Meskaoui (2006-2007). Ce travail a ´et´e pr´esent´e `a plusieurs workshops et a fait l’objet d’une publication dans Microvasular Research.
3.2.1 Motivation
La formation de cordons vasculaires peut ˆetre observ´ee in vitro en ensemen¸cant des cellules sur des biogels. Les conditions requises pour que ce processus d’angio-gen`ese in vitro se produise, ont ´et´e intensivement ´etudi´ees. Cependant, jusqu’`a pr´esent, seules les structures capillaires r´esultantes ont ´et´e caract´eris´ees `a travers des m´ethodes morphom´etriques. Une caract´erisation de la dynamique, c’est `a dire de l’´evolution au cours du temps de ce processus ´etait manquante. Nous avons par cons´equent ´etudi´e sp´ecifiquement cet aspect dynamique, en extrayant `a partir de s´equences d’images, les param`etres morphodynamiques pertinents. Dans cette ´etude, nous nous sommes sp´ecialement int´eress´es `a l’influence de la rigidit´e du biogel sur la formation des cor-dons vasculaires. Nos r´esultats montrent que ce param`etre influence fortement la dyna-mique du processus et que des conditions optimum, dans le contexte de nos exp´eriences, peuvent ˆetre identifi´ees.
3.2.2 Le mod`ele exp´erimental
Les exp´eriences ont ´et´e effectu´ees en utilisant la lign´ee de cellules endoth´eliales Eahy 926, ensemenc´ees `a raison de 20000 cellules/cm2 sur des gels de fibrine obtenus `a partir de la polym´erisation du fibrinog`ene. Des gels de diff´erentes concentrations en fibrinog`ene ont ´et´e consid´er´es en faisant varier la densit´e de monom`eres de 1 `a 3mg/ml. Plus la concentration en fibrinog`ene est grande et plus le gel est rigide. On d´esigne
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par ”flexible”, ”interm´ediaire” et ”rigide” les gels de 1mg/ml, 2mg/ml et 3mg/ml de fibrinog`ene respectivement.
3.2.3 Observations
L’observation in vitro du processus angiog´enique montre l’apparition progressive de lacunes qui ´emergent de l’auto-organisation des cellules (Fig. 3.1a-b). Les lacunes croissent et fusionnent (Fig. 3.1c) jusqu’`a ce qu’un r´eseau de cordons se forme `a leur intersection (Fig. 3.1d).
(a) t = 160min (b) t = 570min
(c) t = 940min (d) t = 1340min
Figure 3.1: Images en contraste de phase montrant 4 ´etapes successives du processus de formation de cordons vasculaires in vitro sur un gel de rigidit´e interm´ediaire.
La dynamique du processus morphog´en´etique (croissance du r´eseau de cordons) est ´evalu´ee `a partir du suivi temporel de 3 param`etres des lacunes : la vitesse de croissance de leur surface, leur indice de forme (rapport grand axe sur petit axe) et la surface associ´ee.
L’´evaluation de la vitesse de croissance moyenne des surfaces (Fig. 3.2a) montre un profil biphasique d’´evolution en fonction de la rigidit´e pour les deux premiers intervalles de temps [0,700] et [700,1200] minutes. Lorsque le processus est plus avanc´e dans le temps on observe que les lacunes continuent de croˆıtre uniquement pour le gel flexible.
Pour les rigidit´es interm´ediaires les donn´ees sont manquantes pour les temps avanc´es puisque le processus est d´ej`a arriv´e `a son terme. L’´evolution temporelle de l’indice de forme des lacunes (Fig. 3.2b) montre qu’il croˆıt au cours du temps quelque soit la rigi-dit´e du gel, ce qui traduit la d´eformation progressive des lacunes sous l’effet des force de tensions exerc´ees par les cellules sur le gel. Les d´eformations apparaissent toujours plus importante dans le cas du gel de rigidit´e interm´ediaire. La mise en correspondance de l’indice de forme (Fig. 3.2a) et de la surface de la lacune (Fig. 3.2b) montre que pour les rigidit´es interm´ediaires, la surface de la lacune atteint rapidement son maximum (t=1020min) puis d´ecroit (t=1500min) tandis que l’indice de forme continue de croˆıtre. Cela signifie que les forces de tensions exerc´ees par les cellules tendent le r´eseau qui at-teint une configuration d’´equilibre m´ecanique. Pour les gels flexibles, ni la d´eformation, ni la surface des lacunes n’´evoluent avant des temps longs (t=2000min). Dans ce cas, le gel est trop flexible pour pouvoir transmettre les forces de tension entre les cellules et aucun r´eseau stable n’´emerge. Pour les gels rigides, les d´eformations des lacunes (Fig. 3.2b) sont beaucoup plus faibles que pour les gels interm´ediaires alors que les surfaces (Fig. 3.2c) sont similaires dans les deux cas. Cela indique que le gel oppose trop de r´esistance `a la d´eformation, bien que les forces d´evelopp´ees soient importantes, puisque les lacunes se d´echirent et fusionnent, retrouvant ainsi temporairement des formes cir-culaires (traduites par la brusque chute de l’indice de forme `a t=1500min) avant de se retendre par la suite (t=2000min).
(a) (b) (c)
Figure 3.2: (a) Vitesse moyenne de croissance des lacunes pour chaque concentration en fibrinog`ene (de 1 `a 3 mg/ml) et pour 4 intervalles de temps successifs, (b) indice de forme moyen et (c) surface moyenne des lacunes, ´evalu´es pour chaque concentration en fibrinog`ene (de 1 `a 3 mg/ml) et pour 4 instants au cours du processus de formation des cordons.
Notre ´etude a permis d’identifier quatre phases dans la morphog´en`ese des cordons qui sont (i) l’apparition des lacunes, (ii) la croissance et les premi`eres fusions de lacunes, (iii) la d´eformation des lacunes, c’est `a dire l’´etirement des cordons et (iv) la stabilisa-tion et/ou la rupture du r´eseau de cordons vasculaires. Notre ´etude montre ´egalement qu’il existe une rigidit´e optimale du biogel pour l’obtention d’un r´eseau stable de cor-dons vasculaires. Il s’agit de la rigidit´e interm´ediaire pour laquelle les forces de traction
3.2 Morphogen`ese de cordons vasculaires in vitro 51
g´en´er´ees par les cellules endoth´eliales et la r´esistance passive du biogel s’´equilibrent rapidement. Cet ´equilibre explique la formation d’un r´eseau capillaire stable `a la fin du processus angiog´enique. Dans le cas des biogels flexibles et rigides (faible r´esistance du biogel et forte traction cellulaire respectivement), cet ´equilibre est difficile `a atteindre. Ce qui conduit `a des structures cellulaires peu connect´ees.
Figure 3.3: Sch´ema de synth`ese des dynamiques de formation des r´eseaux de cordons vasculaires en fonction de la rigidit´e du biogel.
3.2.4 Rigidit´e apparente versus densit´e prot´eique du biogel
Dans l’´etude pr´ec´edente, portant sur l’influence de la rigidit´e du substrat sur la formation de cordons vasculaires in vitro, la rigidit´e a ´et´e modul´ee en faisant varier la concentration en fibrinog`ene pour r´ealiser le biogel de fibrine. Or si ce proc´ed´e permet effectivement de faire varier la rigidit´e de la matrice, il fait ´egalement varier la densit´e de prot´eines d’adh´esion. Il devient donc difficile de d´eterminer, dans quelle mesure les deux param`etres rigidit´e et adh´esivit´e interviennent respectivement dans le processus de formation des cordons.Un mod`ele exp´erimental identique au pr´ec´edent est utilis´e. C’est `a dire l’utilisation de cellules endoth´eliales de la lign´ee Eahy926 ensemenc´ees sur un substrat de fibrine. La rigidit´e apparente du substrat varie en fonction de l’´epaisseur de celui-ci. On utilise la rigidit´e de substrat interm´ediaire (correspondant `a une concentration en fibrinog`ene de 2mg/ml) pour laquelle nous avions pr´ec´edemment obtenu les meilleurs r´esultats quant `a la g´en´eration d’un r´eseau de cordons vasculaires stables. Le gel est alors coul´e dans une boˆıte de p´etri inclin´ee de 10 degr´es afin d’obtenir un gradient d’´epaisseur, c’est `a dire un gradient de rigidit´e pour lequel la densit´e de prot´eines d’adh´esion est constante car fix´ee par la densit´e en fibrinog`ene.
Les images montrant la formation du r´eseau de cordons ont ´et´e acquises 7h apr`es ensemencement des cellules sur le gel. La totalit´e de la boˆıte de P´etri a ´et´e scann´ee ma-nuellement par tranches successives orient´ees dans la direction du gradient de rigidit´e. La structure du r´eseau de cordons le long du gradient d’´epaisseur du gel est visible `a partir de la reconstitution d’une tranche par superposition des images. Les images montrent que la structure du r´eseau varie avec la rigidit´e apparente du substrat. Le nombre de lacunes diminue avec la rigidit´e, par contre leur taille augmente. Dans la
zone plus rigide, les forces de tension exerc´ees par les cellules sur le gel peuvent s’expri-mer pour tendre et faire fusionner les lacunes entre-elles d’o`u leur nombre plus faible et leur taille plus grande. Ce r´esultat correspond aux conclusions de notre pr´ec´edente ´etude et tend `a confirmer que la rigidit´e du gel plutˆot que la densit´e de sites d’adh´esion est le facteur pr´epond´erant dans la morphog´en`ese vasculaire.
Figure 3.4: Reconstitution d’une tranche de l’´echantillon qui montre l’´etat de formation d’un r´eseau de cordons vasculaires 7h apr`es ensemencement des cellules sur une matrice de fibrine pr´esentant un gradient de rigidit´e apparente : gel ´epais `a gauche de faible rigidit´e apparente jusqu’`a un gel fin `a droite de forte rigidit´e apparente.