Modification de l’expression du gène NCoA3 dans les cellules infectées de façon latente et stimulées par

2.3.2.1. Expression des ARNm NCoA3

Les résultats obtenus après hybridation sur micropuces concernant les modifications de l’expression du gène NCoA3 dans les cellules U1 et ACH2 traitées ou non par le NaB sont donnés dans le Tableau 9. L’expression du gène NCoA3 (Unigene Hs. 382168) est augmentée de façon significative de 4,9 à 22,6 fois (rapport des intensités d’hybridation en log2 U1 NaB vs. U1 variant de 2,3 à 4,5 avec une valeur p < 0,00015) après stimulation des cellules U1 par le NaB (Tableau 9A). De même, l’expression du gène NCoA3 est augmentée dans les cellules ACH2 traitées par le NaB par rapport aux cellules non traitées de 2 à 13,9 fois mais de façon moins significative (rapport des intensités d’hybridation en log2 ACH2 NaB vs. ACH2 variant de 1 à 3,8 avec une valeur p < 0,0055) (Tableau 9B). L’expression du gène NCoA3 est donc augmentée lors de la réactivation de la latence des cellules U1 et ACH2 par le NaB.

La modification de l’expression du gène NCoA3 a été validée par des expériences de RT- PCR quantitative. Cinq traitements indépendants de cellules U1 et ACH2 par le NaB ont été réalisés et les ARN ont été extraits après 24 et 48 h. Une PCRq NCoA3 et une PCRq cyclophiline A ont été réalisées en double à partir des ADNc synthétisés. L’expression du gène NCoA3 a été normalisée par rapport à l’expression du gène cyclophiline A. La Figure 40A représente le taux d’activation de l’expression du gène NCoA3 dans les cellules U1 et ACH2 traitées par le NaB pendant 24 et 48 h par rapport aux cellules non traitées. Nous observons une surexpression de l’ARNm NCoA3 dans les cellules U1 stimulées par le NaB de 8,34 ± 2,42 fois par rapport aux cellules non stimulées (Figure 40A). L’expression du gène NCoA3 augmente également après 48 h de traitement par le NaB (surexpression de 8,40 ±

Résultats

101 2,33 fois) (Figure 40A). De façon similaire, nous observons une augmentation de l’expression du gène NCoA3 dans les cellules ACH2 après traitement par le NaB (surexpression de 4,56 ± 1,28 fois après 24 h et surexpression de 6,80 ± 2,34 fois après 48 h de traitement) (Figure 40A). Les résultats obtenus avec les expériences de RT-PCRq confirment ceux obtenus avec les hybridations sur micropuces. La modification d’expression transcriptionnelle du gène NCoA3 est donc validée.

Nous avons voulu déterminer si l’expression du gène NCoA3 était modifiée de la même façon après traitement par le NaB des cellules parentales non infectées U937 et CEM. Le gène NCoA3 est également surexprimé dans les cellules U937 (surexpression de 7,32 ± 1,74 fois après 24 h et surexpression de 11,45 ± 2,95 fois après 48 h de traitement) et CEM (surexpression de 1,93 ± 1,04 fois après 24 h et surexpression de 5,59 ± 0,06 fois après 48 h de traitement) traitées par le NaB (Figure 40B).

Nous avons réalisé des expériences supplémentaires afin de déterminer si les variations d’expression du gène NCoA3 pouvaient être observées après traitement des cellules par l’ester de phorbol PMA et par un autre inhibiteur d’HDAC, la trichostatine A (TSA). L’expression du gène NCoA3 est augmentée après traitement par le PMA des cellules U1 (surexpression de 5,70 ± 1,37 fois après 24 h et surexpression de 9,85 ± 0,90 fois après 48 h de traitement) et ACH2 (surexpression de 3,12 ± 1,05 fois après 24 h et surexpression de 7,12 ± 1,20 fois après 48 h de traitement) (Figure 40C). Le traitement par la TSA n’a pas d’effet sur l’expression du gène NCoA3 dans les cellules U1 et ACH2 (résultat non montré). L’expression du gène NCoA3 est augmentée après traitement des cellules U1 et ACH2 par un ester de phorbol mais pas par un autre inhibiteur d’HDAC.

Nous avons également analysé l’expression différentielle du gène NCoA3 dans deux autres lignées cellulaires infectées de façon latente par le VIH-1 : la lignée promonocytaire OM10.1 (Butera et al., 1991) et la lignée de lymphocytes T CD4+ J1.1 (Perez et al., 1991).

NaB

-

+

-

+

-

+

-

+

α-NCoA3

α-actine

Figure 41. Analyse de l’expression de la protéine NCoA3 par Western-Blot.

Les extraits nucléaires (100 µg) des cellules U1, ACH2, OM10.1 et J1.1 traitées (+) ou non (-) par le NaB pendant 24 h ont été séparés sur gel SDS-PAGE à 8% et transférés sur membrane. La protéine NCoA3 est détectée à l’aide d’un anticorps α-NCoA3 (en haut). La quantité de protéines a été normalisée en utilisant un anticorps α-actine (en bas). Ces résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

Résultats

102 Les cellules OM10.1 et J1.1 ont été ou non traitées pendant 24 et 48 h par du NaB et des RT- PCRq ont été réalisées sur les ARN extraits pour mesurer l’expression du gène NCoA3 (Figure 40D). L’expression du gène NCoA3 est augmentée de 4,94 ± 0,78 fois dans les cellules OM10.1 et de 2,56 ± 0,64 fois dans les cellules J1.1 après 24 h de traitement par le NaB (Figure 40D). L’expression du gène NCoA3 augmente avec le temps de traitement par le NaB dans les deux lignées cellulaires (surexpression de 12,89 ± 3,10 fois dans les cellules OM10.1 et surexpression de 3,51 ± 0,69 fois dans les cellules J1.1) (Figure 40D). L’expression différentielle du gène NCoA3 est donc similaire dans deux autres modèles de lignées cellulaires infectées de façon latente par le VIH-1.

2.3.2.2. Expression de la protéine NCoA3

Nous avons ensuite voulu confirmer que les modifications observées au niveau des ARNm de NCoA3 corrèlent avec l’expression la protéine NCoA3. Nous avons réalisé des extraits nucléaires de cellules U1, ACH2, OM10.1 et J1.1 traitées ou non pendant 24 h par du NaB. Les protéines nucléaires ont été séparées sur gel SDS-PAGE puis la protéine NCoA3 a été révélée par un anticorps spécifique (Figure 41). Les quantités de protéines déposées ont été normalisées par hybridation avec un anticorps dirigé contre l’actine. Les résultats montrent que le NaB augmente l’expression de la protéine NCoA3 dans les cellules U1, ACH2, OM10.1 et de façon moindre dans les cellules J1.1 (Figure 41). Ces résultats corrèlent avec l’expression différentielle du gène NCoA3 observée par les expériences d’hybridation sur micropuces et de RT-PCRq. L’expression de la protéine NCoA3 est donc augmentée après traitement des cellules infectées de façon latente par le NaB.