3.1. Analyse des interactions protéiques
3.1.1. « GST pull-down »
Les protéines de fusion GST sont produites dans des bactéries BL21 recombinantes contenant le plasmide pGST-Tat. Après induction de l’expression pendant 4 h à 30°C avec 0,1 mM d’IPTG (« Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside »), les bactéries sont centrifugées puis incubées 1 h à 4°C dans un tampon de lyse (20 mM Hepes pH 7,9, 1 mM MgCl2, 500 mM KCl, 17% glycérol, 1 mM DTT) puis soniquées. Après une centrifugation de 10 min à 10000 g, le surnageant contenant la protéine de fusion GST est incubé avec des billes de Glutathion Sepharose 50% (Amersham Biosciences) pendant 1 h à 4°C. Les extraits protéiques totaux (2
mg) sont alors incubés toute la nuit à 4°C sous agitation en présence des billes de Glutathion Sepharose auxquelles sont fixées les protéines de fusion GST. Les billes sont ensuite rincées 5 fois avec du tampon de lyse puis reprises dans 20 µL de tampon de Laemmli 2X (130 mM Tris pH 6,8, 4% SDS, 0,02% bleu de bromophénol, 20% glycérol, 10% β-mercaptoéthanol).
3.1.2. Immunoprécipitation
Les extraits protéiques totaux (2 mg) sont incubés toute la nuit à 4°C en présence de 2 µg d’anticorps sous agitation. La protéine G Sepharose 50% (Amersham Biosciences) est ajoutée sur les complexes Ag-Ac pendant 4 h à 4°C. Les billes sont ensuite rincées 5 fois avec du tampon de lyse puis reprises dans 20 µL de tampon de Laemmli 2X.
3.2. Analyse des interactions ADN-protéines par « DNA pull-down »
Cent pmoles d’oligonucléotides biotinylés double brin sont incubés avec 1 mg de billes magnétiques couplées à la Streptavidine (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal) pendant 30 min, puis les billes sont rincées et reprises dans du tampon de liaison (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 75 mM KCl, 1mM DTT, 10% glycérol). Vingt cinq pmoles d’oligonucléotides couplés aux billes magnétiques sont alors mélangés à 100 µg d’extraits nucléaires dans 25 µL de tampon de liaison avec 1µg de SAB et 1µg de poly-dIdC pendant 45 min à 4°C. Des expériences de chasse spécifique et non spécifique sont réalisées avec un excès d’oligonucléotide non biotinylé sauvage ou mutant. Les complexes ADN-protéines sont récupérés par aimantation, puis les billes sont rincées et reprises dans 20 µL de tampon de Laemmli 2X.
Matériels et Méthodes
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3.3. Electrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immuno-
empreinte (Western-Blot)
Les échantillons protéiques additionnés de tampon de Laemmli sont dénaturés 5 à 10 min à 95°C et sont déposés sur un gel d’acrylamide/bis-acrylamide 37.5-1 de concentration variable et séparés par électrophorèse en conditions dénaturantes. La migration s’effectue en tampon de migration 1X (3 g/L Tris/base, 14,4 g/L glycine, 1 g/L SDS) à 110 V. Après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad) durant la nuit à 30 V et à 4°C en tampon de transfert 1X (3 g/L Tris/base, 14,4 g/L glycine, 20% éthanol). La membrane est alors colorée au rouge ponceau, puis rincée au PBS 1X. Les sites non spécifiques sont bloqués dans du PLT (PBS 1X, 5% lait écrémé Régilait, 0,05% Tween 20).
L’analyse des protéines est réalisée après incubation de la membrane avec une dilution d’anticorps primaire dirigé contre la protéine d’intérêt, rinçages, incubation avec un anticorps secondaire couplé à la HRP et rinçages. La révélation se fait par mise en contact de la membrane avec une solution d’ECL (« Enhanced Chemiluminescence », Amersham Biosciences) pendant 1 min puis exposition d’un film photographique.
3.4. Extraction d’ADN génomique
L’extraction d’ADN génomique (ADNg) est réalisée en utilisant le kit « QIAamp DNA Mini kit » (Qiagen) selon les recommandations du fabricant. Le culot cellulaire est repris dans 200 µL de PBS et lysé avec 200 µL de tampon AL, puis la protéase est ajoutée et le mélange est incubé 10 min à 65°C. Après ajout de 200 µL d'éthanol, le mélange est déposé sur colonne et après plusieurs lavages, l'ADNg est élué par du tampon AE.
3.5. Extraction d’ARN
Les ARN sont extraits soit par utilisation du Trizol® (Invitrogen), soit par utilisation du kit « RNeasy Mini Kit » (Qiagen). Dans la première technique, les cellules sont lysées par l’addition de Trizol®, puis les ARN sont extraits au phénol/chloroforme et concentrés par une précipitation alcoolique. Dans la deuxième technique, les cellules sont lysées dans un tampon RLT contenant du β-mercaptoéthanol, le lysat est clarifié sur une colonne « QIAshredder » et de l’éthanol est ajouté. Le mélange est déposé sur colonne et un traitement à la DNase I est réalisé selon les recommandations du fabricant. Après plusieurs lavages, l’ARN est élué. La qualité et la concentration des ARN sont estimées par mesure des absorbances à 260 et 280 nm au spectrophotomètre (Pharmacia Biotech).
3.6. Hybridation sur micropuces
Les ARN totaux extraits des cellules U1 et ACH2 stimulées ou non par le NaB pendant 24 h ont été envoyés au Dr. C. Thibault à la plate-forme Affymetrix de l’IGBMC de Strasbourg pour amplification, marquage et hybridation sur les micropuces U-133A (Affymetrix) contenant 22283 spots d’oligonucléotides. Les résultats sont analysés avec le logiciel Mas5.0 (Affymetrix) et interprétés avec les logiciels Data Mining Tool (Affymetrix) et Microsoft Excel. Pour les analyses individuelles, un gène est considéré comme exprimé si la valeur p est inférieure à 0,048. Pour les analyses comparatives, un gène est surexprimé si le rapport des intensités d’hybridation en log2 est supérieur ou égal à 1 et un gène est sous- exprimé si le rapport des intensités d’hybridation en log2 est inférieur ou égal à 1. Les changements d’expression des gènes sont considérés comme significatifs lorsque la valeur p est ≤ 0,0001 pour les gènes surexprimés et la valeur 1-p est ≥ 0,9999 pour les gènes sous- exprimés.
Gènes Amorces a Séquences (5’ å 3’) CD4 CD4 S CD4 AS GAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAA GTCAGAGTTGGCAGTCAATCC CXCR4 CXCR4 S CXCR4 AS TTTAAATTAAGCTTGCAAAGTGACGCCGAGGGCCTGAG TTTAAATCTAGAAAG CAATAAAAACTGTACAATATTGGTC CCR5 CCR5 S CCR5 AS AAAAAATCAATGTGAAGCAAATCG GAAGGAAAAACAGGTCAGAGATGG cyclophiline A Cyclo S Cyclo AS AGCACTGGAGAGAAAGGATT GGAGGGAACAAGGAAAACAT
Gènes Amorces a Séquences (5’ å 3’)
NCoA3 NCoA3 S NCoA3 AS CTTTGGGCATTCCTGAACTTGTC GCCTCATCACCGCAGCAC IRF8 IRF8 S IRF8 AS GGAGTGCGGTCGCTCTGAAA GTCGTAGGTGGTGTACCCCGTCA GAPDH GAPDH S GAPDH AS GGGAAACTGTGGCGTGAT GGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT cyclophiline A Cyclo S Cyclo AS AGTGGTTGGATGGCAAGC GATTCTAGGATACTGCGAGCAAA Gènes Amorces a et sondes b Séquences (5’ å 3’) gag Gag S Gag AS Gag TM * GACGCTCTCGCACCCATCTC CTGAAGCGCGCACGGCAA TAGCCTCCGCTAGTCAAAATTTTTGGCGTXcTd cyclophiline A Cyclo S Cyclo AS Cyclo FL * Cyclo LC * CATCTGCACTGCCAAGACTGAG AGGGAACAAGGAAAACATGGAA CCTCCACCCCATTTGCTCGCAGTAe CCTAGAATCTTTGTGCTCTCGCTGCAGTf aS : amorce sens, AS : amorce antisens.
b* : sonde.
cX : groupe 5-carboxytetramethylrhodamine.
dModifié en 5’ par la 6-carboxyfluorescéine et phosphorylé en 3’. eModifié en 3’ par la fluorescéine.
fModifié en 5’ par le fluorophore LC red 640 et phosphorylé en 3’.
Tableau 1. Séquences des amorces et des sondes utilisées en PCR semi-quantitative (A), en PCRq (B) et en RT-PCRq (C).
A
B
3.7. Transcription inverse et amplification par polymérisation en chaîne
(RT-PCR, « Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction »)
3.7.1. Transcription inverse
La transcription inverse est réalisée sur 1 µg d’ARN total, traité par 1 U de DNase I (DNase I Amplification Grade, Invitrogen) pendant 15 min dans un volume final de 10 µL. L’ARN est incubé en présence de 200 ng d’oligo-dT et de 0,5 mM de dNTP pendant 10 min à 65°C. La synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) est réalisée en présence de tampon 1X First-Strand, de 10 mM de DTT, de 40 U d’inhibiteur de RNase (RNaseOUTTM, Invitrogen), et de 200 U de transcriptase inverse de MoMLV (SuperScriptTM II RNase H- Reverse Transcriptase, Invitrogen), 50 min à 42°C puis 15 min à 70°C.
3.7.2. PCR semi-quantitative
A un dixième des ADNc produits par RT sont ajoutés 200 ng de chaque amorce spécifique, 3 mM de MgCl2, 0,25 mM de dNTP et 2,5 U de Taq DNA Polymérase (Invitrogen). L’amplification est réalisée grâce à un thermocycleur (PTC-200 DNA Engine, MJ Research) avec le programme suivant : 1 cycle de 10 min à 94°C, 25 cycles composés d’une dénaturation de 30 s à 94°C, d’une hybridation de 30 s à la température d’hybridation des amorces (54°C pour les PCR CD4 et cyclophiline A et 57°C pour les PCR CXCR4 et CCR5) et d’une élongation de 30 s à 72°C, suivi d’un dernier cycle de 10 min à 72°C. Les séquences des amorces utilisées sont données dans le Tableau 1A.
3.7.3. PCR quantitative (PCRq)
Les ARNm sont quantifiés avec l’appareil Light Cycler (Roche Diagnostics). Les PCRq sont réalisées sur 1/10 des ADNc synthétisés dans un mélange réactionnel de 20 µL contenant le tampon 1X Light Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics), 4 mM de MgCl2 et 500 nM de chaque amorce. Les amorces ont été dessinées à l’aide du logiciel
Matériels et Méthodes
82 Oligo 6 et les séquences sont données dans le Tableau 1B. Les étapes de la PCRq sont : une dénaturation de 10 min à 95°C suivie de 45 cycles de 10 s à 95°C, 5 s à la température d’hybridation des amorces (55°C pour les PCRq NCoA3 et cyclophiline A, 59°C pour la PCRq IRF8 et 64°C pour la PCRq GAPDH), et 20 s à 72°C. Une courbe de fusion est réalisée à la fin de la PCR afin de vérifier que chaque couple d’amorce amplifie un seul produit. Les réactions sont réalisées en double et les quantifications sont déterminées en référence à une courbe standard préparée en diluant en série un produit de PCR contenant la séquence cible. Les résultats sont analysés en utilisant la méthode « second-derivative-maximum » fournie par le logiciel de quantification du Light Cycler (version 3.5). L’expression des gènes est normalisée par rapport à l’expression du gène cyclophiline A.
3.7.4. RT-PCR quantitative (RT-PCRq)
Les RT-PCRq sont réalisées sur 2 µL d’ARN dans un mélange réactionnel de 20 µL contenant le tampon 1X Light Cycler FastStart RNA Master Hybridization Probes (Roche Diagnostics), 3,25 mM de Mn(OAc)2, 500 nM de chaque amorce, et 200 nM de sonde « TaqMan » (RT-PCRq gag) ou 200 nM de chaque sonde d’hybridation (RT-PCRq cyclophiline A). Les séquences des amorces et des sondes sont données dans le Tableau 1C. Les étapes de la RT-PCRq sont : une transcription inverse de 25 min à 61°C, une dénaturation de 2 min à 95°C suivie de 45 cycles de 10 s à 95°C et 40 s à 60°C pour la RT-PCRq gag ou de 45 cycles de 1 s à 95°C, 10 s à 56°C et 15 s à 72°C pour la RT-PCRq cyclophiline A (Brussel and Sonigo, 2004). Les réactions sont réalisées en double et les quantifications sont déterminées en référence à une courbe standard préparée en diluant en série un ARN transcrit in vitro contenant la séquence cible (don du Dr. A. Brussel, IC, Paris) (Brussel and Sonigo, 2004). Les résultats sont analysés comme décrit précédemment.
Résultats
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