2.1. Entretien des cellules
Les cellules non adhérentes sont cultivées dans du milieu RPMI1640 (Invitrogen) complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) décomplémenté, 50 U/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine et 2 mM de glutamine (Invitrogen). Lorsque la densité cellulaire est importante, les cellules sont diluées de façon à maintenir une concentration d’environ 106 cellules par mL.
Les cellules adhérentes sont entretenues dans du milieu DMEM (« Dulbecco’s Modified Eagle Medium », Invitrogen) à 4,5 g/L de D-glucose, supplémenté avec 5% de SVF décomplémenté, 50 U/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine et 2 mM de glutamine (Invitrogen). Lorsque les cellules sont confluentes, le milieu est retiré, les cellules sont rincées au PBS 1X, décrochées par ajout de trypsine (Trypsine/EDTA 1X, Invitrogen) et reprises dans du milieu neuf. Les cellules sont incubées en atmosphère humide contenant 7% de CO2 à 37°C.
2.2. Isolement, culture et mise en différenciation des préadipocytes
Le tissu adipeux prélevé est découpé puis digéré avec 2 mg/mL de collagénase A (Roche Diagnostics) et 20 mg/mL de sérum albumine bovine (SAB) pendant 2 h à 37°C. Après filtration, les préadipocytes sont isolés par une centrifugation de 10 min à 800 g et les érythrocytes sont lysés par un tampon contenant 154 mM de NH4Cl, 10 mM de KHCO3 et 0,1 mM d’EDTA.
Les cellules primaires de préadipocytes et les cellules de la lignée PAZ6 sont cultivées dans du milieu 50% Ham’s F12 et 50% DMEM à 4,5 g/L de D-glucose, supplémenté avec
10% de SVF décomplémenté, 20 mM d’Hepes, 50 U/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine et 2 mM de glutamine (Invitrogen).
Lorsque les cellules arrivent à confluence, elles sont mises en différenciation en ajoutant au milieu de culture un mélange de différenciation (Mix) contenant 8,5 nM d'insuline, 1 µM de dexamethasone, 1 µM de pioglitazone, 1 nM de triiodothyronine (T3) et 0,25 mM d'IBMX (« Isobutyl Methyl Xanthine ») (Sigma).
2.3. Stimulations cellulaires
Les cellules sont comptées, centrifugées et le culot cellulaire est repris dans du milieu neuf afin d’obtenir une suspension cellulaire à 106 cellules par mL. Le NaB est ajouté au milieu à une concentration finale de 10 mM (Sigma), le PMA à une concentration finale de 10 ng/mL (Sigma) et la TSA à une concentration finale de 300 nM (Sigma). Les cellules sont stimulées pendant 24 ou 48 h.
2.4. Transfections transitoires
2.4.1. Co-précipitation au phosphate de calcium
La veille de la transfection, les cellules sont mises en culture en puits de 35 mm de diamètre ou en boîte de 10 cm de diamètre. Le milieu de culture est remplacé respectivement par 3 ou 10 mL de milieu DMEM neuf, au moins 4 h avant la transfection. Le mélange de transfection est composé, pour un puits de 35 mm, de 150 µL de tampon HBS (25 mM Hepes pH 7,05, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,75 mM Na2HPO4, 6 mM glucose), de 3 µg d’ADN plasmidique et de 9,3 µL de CaCl2 2 M ajoutés goutte à goutte sous agitation modérée ; ou pour une boîte de 10 cm, de 500 µL d’HBS, 10 µg d’ADN plasmidique et 31 µL de CaCl2. Le
Matériels et Méthodes
75 mélange est incubé 20 min à température ambiante. Le précipité est ensuite ajouté directement sur les cellules.
2.4.2. Lipides cationiques (FuGENE6 ®)
La veille de la transfection, 2.105 cellules sont mises en culture par puits de 35 mm de diamètre. Le milieu de culture est remplacé par un mélange de 50% de milieu neuf et 50% de milieu conditionné, 4 h avant la transfection. Le mélange de transfection est composé de 94 µL de DMEM sans SVF ni antibiotiques, 6 µL de FuGENE6® (Roche Diagnostics) et de 3 µg d’ADN plasmidique. Après 15 à 20 min de précipitation, le mélange est ajouté goutte à goutte sur les cellules.
2.4.3. Nucléofection
Cinq ou 2 millions de cellules U1 sont centrifugées 5 min à 1000 g puis le culot est repris dans 100 µL de solution NucleofectorTM V (Amaxa Biosystems) contenant 5 µg d’ADN plasmidique ou 1 à 2 µM d’ARNi. Les cellules sont placées dans une cuve et transfectées en utilisant le programme V-01 de l’appareil NucleofectorTM (Amaxa Biosystems). Les cellules sont ensuite reprises dans du RPMI-10% SVF et incubées à 37°C.
2.5. Mesure de l’activité β-galactosidase
L’activité β-galactosidase est mesurée par la modification du substrat CPRG (« Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside »). Les cellules sont lysées dans un tampon de lyse (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 10 mM MgSO4, 2,5 mM EDTA, 1,25‰ NP40, 50 mM β-mercaptoéthanol), puis du tampon de réaction CPRG (61,9 mM Na2HPO4, 18,1 mM NaH2PO4, 10 mM MgCl2, 10 mM β-mercaptoéthanol, 6 mM CPRG) est ajouté volume à volume. Une cinétique d’activité β-galactosidase est alors réalisée par mesure de l’absorbance à 575 nm.
2.6. Mesure de l’activité luciférase
L’activité luciférase est mesurée après lyse des cellules dans du tampon LB (25 mM Tris- phosphate pH 7,8, 8 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 15% glycérol). Le lysat est transféré dans un tube Rohren (Sarstedt). La lecture s’effectue sur 5 ou 30 s au luminomètre Berthold (Lumat LB 9507) après ajout de 100 µL d’une solution LB contenant de 0,25 mM de luciférine et 1 mM d’ATP.
2.7. Préparation d’extraits protéiques nucléaires et totaux
Les cellules sont centrifugées 5 min à 1000 g, reprises dans du PBS 1X froid, et centrifugées 3 min à 3000 g à 4°C. Pour la réalisation des extraits nucléaires, le culot cellulaire est repris dans du tampon I (50 mM Tris pH 7,9, 10 mM KCl, 10% glycérol, 1 mM EDTA, 0,4% NP40, 1% cocktail d’inhibiteurs de protéases Sigma). Après une centrifugation de 3 min à 3000 g à 4°C, le culot de noyaux est repris dans du tampon II (20 mM Hepes pH 7,9, 400 mM NaCl, 10 mM KCl, 20% glycérol, 1mM EDTA, 1% cocktail d’inhibiteurs de protéases Sigma), incubé 20 min à 4°C puis centrifugé 10 min à 15000 g à 4°C. Le surnageant (extrait nucléaire) est récupéré et la concentration en protéines est déterminée.
Pour la réalisation des lysats totaux, le culot cellulaire est repris dans du tampon de lyse (20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycérol, 0,1% NP40, 1mM DTT, 1% cocktail d’inhibiteurs de protéases Sigma), incubé 15 min à 4°C puis centrifugé 10 min à 15000 g à 4°C. Le surnageant (lysat total) est récupéré et la concentration en protéines est déterminée.
Le dosage des protéines est réalisé par la technique de Bradford. Un µL d’extrait protéique est ajouté à un mélange de 250 µL de réactif Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad) et d’1 mL d’eau. L’absorbance est mesurée au spectrophotomètre à 595 nm.
Matériels et Méthodes
77
2.8. Production de virus pseudotypés
Les virus pseudotypés sont obtenus après co-transfection au chlorure de calcium de cellules HEK293 du plasmide proviral pNL4.3∆env-luc et d’un plasmide codant pour une protéine d’enveloppe, en boîte de 10 cm de diamètre. Après 48 h de transfection, les surnageants contenant les virus sont prélevés, centrifugés, filtrés sur membrane de 0,45 µm de diamètre, aliquotés et congelés à -80°C. Les virus ainsi obtenus sont titrés par dosage de la protéine p24 et testés en infection sur des cellules cibles.
2.9. Quantification de la production virale
La quantification de la production virale se fait par dosage de la protéine p24 des surnageants à l’aide d’un test ELISA. On utilise le kit « HIV-1 p24 Antigen Assay » de Coulter.