MATERIEL ET METHODES
E. MODELES DE CULTURE EN 3D
Deux modèles de PR ont été utilisés dans ce document: avec et sans substrat dermique. Quel que soit le modèle de culture 3D, la préparation se fait selon les mêmes séquences et la même cinétique à partir des cellules préalablement amplifiées en monocouche (FIGURE 37).
Figure 37: représentation simplifiée de la cinétique de préparation des peaux reconstruites
1. MODELE SUR EPONGE PORREUSE
Le substrat dermique développé et breveté au Laboratoire des Substituts Cutanés est composé d’un mélange à base de collagène bovin de type I et III (72%), de glycosaminoglycanes (8%) réticulés par du chitosan (20%) et lyophilisé. Il sert de support à la reconstruction du derme équivalent après ensemencement des fibroblastes à la densité de 250 000 cellules/cm² dans du MCDE. Il est cultivé durant 21 jours avec ajout dès le premier changement de milieu de l’EGF et de la vitamine C extemporanément. Les milieux sont changés chaque jour y compris le samedi et le dimanche.
Après 21 jours de culture, les kératinocytes sont ensemencés à la surface du derme équivalent à la densité de 250 000 cellules/cm², et cultivé 1 semaine supplémentaire en MCPR avant d’être émergé. L’élévation à l’interface air/liquide permet la différenciation et stratification des kératinocytes. Les PR sont cultivées dans du MAL pendant le temps défini dans chaque protocole. Le milieu est alors changé trois fois par semaine jusqu’à l’arrêt des cultures où les
Les fibroblastes sont ensemencés sur la membrane polyester de porosité de 0,4 μm d’un insert. Toutes les étapes de cultures sont les mêmes, mais la densité est de 40 000 cellules/cm2, pour les fibroblastes comme pour les kératinocytes
Quel que soit le modèle, le temps de culture, les cellules et le type de fixation, au minimum n=3 peaux reconstruites sont prévues pour chaque condition.
II. ANALYSES HISTOLOGIQUES ET IMMUNO-HISTOLOGIQUES
L’histologie et l’immuno-histologie sont réalisés sur les peaux reconstruites après arrêt des cultures et fixation des échantillons en paraformaldéhyde à 4% (PFA) ou congélation puis inclusion en Tissu Teck (OCT). Les échantillons fixés à la PFA subissent un cycle de déshydratation pour être inclus en paraffine.
Les coupes de 5μm d’épaisseur sont déposées sur les lames SUPER FROST ULTRA PLUS. La coloration à l’Hématoxyline-Phloxyne-Safran (HPS) réalisée sur les coupes paraffines par le laboratoire d’Anatomo-Pathologie des Hospices Civils de Lyon permet d’observer la morphologie générale des échantillons.
Les marquages, sont réalisés soit sur coupe paraffine soit sur coupe congelée en fonction de la spécificité de l’anticorps (TABLEAU 10).
Pour les coupes paraffine:
La première étape consiste à déparaffiner les coupes grâce à la succession de trois bains de méthylcyclohexane, deux bains d’éthanol absolu, un bain d’éthanol 95° et un bain d’éthanol 70° durant 5 minutes chacun. Les lames sont ensuite réhydratées pendant 30 minutes à l’eau courante. Un démasquage des sites antigéniques est suivi d’un traitement à l’eau oxygénée pour inhiber l’action des peroxydases endogènes. Les coupes sont alors incubées dans une solution de saturation composée de PBS-BSA à 4%. Puis, l’anticorps primaire est appliqué 1h à température ambiante ou O/N à 4°C. Après 3 rinçages, l’anticorps secondaire correspondant est incubé pendant 45 min à température ambiante. Pour une révélation en fluorescence, l’anticorps secondaire est couplé à un fluorochrome et les noyaux sont colorés avec un intercalant de l’ADN (Hoechst 33342 ThermoFisher Scientifique). Dans le cas d’une révélation dans le visible par histochimie, l’anticorps secondaire couplé à une péroxydase chromophore (Envision, Dakocytomation, Glostrup, Denmark), la revelation est réalisée par l’ajout du substrat 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), puis le reste du tissu est contre-coloré avec de l’hématoxyline de Harris. Enfin, le montage des coupes entre lame et lamelle est réalisé à l’aide d’un milieu de montage aqueux (Dako Faramount Aqueous Mounting Medium) ou spécifique
Après séchage des lames à l’air, les coupes sont fixées par de l’acétone, du méthanol ou de l’éthanol glacial durant 10 min puis rincées. Comme précédemment, elles sont incubées dans une solution de saturation composée de PBS-BSA à 4%. Puis, l’anticorps primaire est appliqué 1h à température ambiante ou O/N à 4°C. Après 3 rinçages, l’anticorps secondaire correspondant est incubé pendant 45 min à température ambiante. La révélation se fait uniquement en fluorescence.
Après séchage des lames à plat, les images sont réalisées à l’aide d’un microscope optique ECLIPSE 50i (Nikon) ou via un microscope confocal Zeiss LSM 510.
type de fixation et dilution utilisée)
Anticorps Fabricant Clone et réactivité Type d’échantillon dilution
αSMA Novotec Αsm-1 - Monoclonal souris paraffine 1/1000 Collagène I Novotec Polyclonal lapin OCT 1/500 Collagène de type III Novotec 8D1-8C7 - Monoclonal souris OCT 1/250 Cytokératine K15 Thermofischer LKH15 - monoclonal souris paraffine 1/20
Décorine Abcam Monoclonal souris paraffine 1/1000 Elastine Novotec Polyclonal lapin OCT 1/100 Fibrilline Neo-markers 11C1 - Monoclonal, souris OCT 1/100 Fibulin 5 Sigma Polyclonal lapin Paraffine 1/200 Filaggrine Novocastra 15C10 - Monoclonal souris paraffine 1/25 Integrine β1 Santa Cruz P5D2 – Monoclonal souris OCT 1/100 Integrine a6 Millipore NIK-GoH3 –Monoclonal rat OCT 1/500 Ki67 Dako MIB1 – Monoclonal souris Paraffine 1/50 Laminine 5 Chemicon Ms X Hu clone P3H9-2 OCT 1/100
Loricrine Abcam Monoclonal lapin Paraffine 1/500 Lysyl oxidase Lox Abcam PHD1 OCT 1/300 MFAP4 Sigma Polyclonal Lapin Paraffine 1/50
III. ANALYSE QUANTITATIVE D’IMAGE
Afin de bien comprendre comment peuvent être analysées des images de microscopie, j’ai choisi d’introduire un rappel sur la composition d’une image numérique et les informations susceptibles d’être extraites. Une fois les bases posées il sera plus facile de comprendre les méthodes et outils utilisés pour analyser les images et obtenir des données chiffrées qu’il est possible d’exploiter de façon quantitative ou semi quantitative.