Mod´elisation des sauts

Pour v´erifier l’hypoth`ese d’un processus de diffusion 3D compl´ementaire au sliding, et afin de comprendre l’influence des diff´erents param`etres, nous avons calcul´e les cumu-latives analytiques associ´ees `a un mod`ele de diffusion 3D. Cette ´etude fait l’objet d’une collaboration avec Claude Loverdo, Rapha¨el Voituriez et Olivier B´enichou, du Laboratoire de Physique Th´eorique de la Mati`ere Condens´ee de l’UPMC.

III.3.4.1 Description du mod`ele

Nous utilisons les coordonn´ees cylindriques. L’ADN est mod´elis´e par un cylindre de longueur L selon l’axe z et de rayon a⋆ (L= 2,2 µm et a⋆= 1nm). Pour prendre en compte la taille de l’enzyme, nous prenons un rayon hydrodynamique effectif a tel que a = a⋆+RH, o`u RH est le rayon de l’enzyme. L’enzyme quitte l’ADN `a t = 0 et y revient `a l’instant t. Elle diffuse `a 3 dimensions avec un coefficient D3. Selon les observations exp´erimen-tales, nous consid´erons que l’enzyme est perdue si l’excursion `a 3D dure plus longtemps que tobs= 2∆t = 40 ms ou si elle se rattache en dehors du segment [0, L] (cf. Figure III.16). Soit P (z|tobs) la probabilit´e de faire un saut de taille z pendant le temps d’observation tobs. P (z|tobs) peut ˆetre reli´ee `a P (z|t), la probabilit´e de s’ˆetre d´eplac´e d’une distance z pendant le temps t :

P (z|tobs) = Z tobs

0

P (z|t)f(t)dt, (III.30)

o`u f (t) est la probabilit´e de revenir sur le cylindre `a l’instant t.

Le probl`eme est invariant par translation selon z : f (t) peut ˆetre ramen´ee `a la pro-babilit´e en deux dimensions de revenir sur un disque de rayon a `a l’instant t en ayant

EcoRV saute aussi

quitt´e r0 `a l’instant t = 0. `A chaque rencontre avec le cylindre de l’ADN, l’enzyme a une probabilit´e finie de s’adsorber. Cette hypoth`ese n´ecessite d’introduire un param`etre κ, caract´eristique de la longueur de ce processus d’adsorption. La transform´ee de Laplace F (s) de f (t) peut alors ˆetre exprim´ee en fonction de K, la fonction de Bessel modifi´ee de seconde esp`ece comme suit [96] :

F (s) = K0  a^{r s} D3  K0  a^{r s} D3  + κ−1r s D3× K1  a^{r s} D3  . (III.31)

Inverser cette fonction n’est analytiquement pas facile, cela est fait num´eriquement [97]. Nous pouvons ensuite calculer l’int´egrale de la densit´e de sauts :

c (z, tobs) = Z L

z

P (u, tobs)× ^{L− u}_L du. (III.32)

o`u le facteur ^L− u

L ^{rend compte de la taille finie de l’ADN. La probabilit´e qu’une} en-zyme s’´echappe de l’ADN pendant le temps tobs est donn´ee par 1− c(0, tobs). Lorsque l’enzyme s’´echappe, l’interaction est consid´er´ee comme termin´ee. D’o`u l’expression du nombre moyen Ntot de sauts par interaction :

Ntot = ¹

1− c (0, tobs)^.

La probabilit´e d’observer un saut de taille sup´erieure `a z correspond au produit de la densit´e de probabilit´e de saut sup´erieur `a z par le nombre moyen de sauts :

C (z, tobs) = Ntot c (z, tobs) .

C (z, tobs) ´equivaut `a la cumulative invers´ee normalis´ee exp´erimentale. κ est le seul para-m`etre ajustable dans ces calculs.

III.3.4.2 R´esultats pour EcoRV - Cy3B

En prenant les valeurs : a = 5 nm et D3 = 54 µm2.s−1, justifi´ees par les mesures de FCS d´ecrites au chapitre pr´ec´edent (partie II.2.4.3) et une taille de l’ADN L = 2,2 µm, ce mod`ele a permis d’obtenir des courbes analytiques des cumulatives qui se superposent tr`es bien aux points exp´erimentaux pour l’enzyme marqu´ee `a Cy3B dans le tampon Pipes (cf. Figure III.17). Les valeurs du param`etre d’adsorption κ pour le Pipes `a pH=6,8 et `a pH=7,5 sont respectivement κ6,8 = 1,5 nm−1 et κ7,5 = 3 nm−1.

Dans les autres tampons (Hepes et Tris), la concordance exp´erience-calcul n’est que qualitative. Un mod`ele plus complet qui prendrait en compte les effets ´electrostatiques devrait permettre de r´eduire ces ´ecarts.

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18

EcoR V - Cy3B dans le Pipes Points expérimentaux pH=6.8 pH=7.5 Calculs numériques =1.5 = 3 C u m u l a t i v e I n v e r s é e R e n o r m a l i s é e

Taille des sauts (µm)

Figure III.17: Superposition des cumulatives renormalis´ees exp´erimentales (ronds et car-r´es) et analytiques (traits continus) pour les sauts observ´es avec l’enzyme EcoRV-Cy3B dans le tampon Pipes. Haut : pH= 6,8 - Bas : pH=7,5.

III.3.4.3 Conclusions `

A partir d’un mod`ele simple, nous parvenons `a expliquer les sauts d’EcoRV observ´es exp´erimentalement. Ce mod`ele consiste `a assimiler les sauts `a des excursions 3D : la prot´eine quitte l’ADN, diffuse `a 3D dans l’espace puis se r´eassocie sur l’ADN, cela en un temps limit´e pour rendre compte des conditions exp´erimentales : si l’enzyme n’est pas revenue sur l’ADN, nous consid´erons qu’elle est perdue. Ce mod`ele apporte deux informations importantes :

⋆ L’enzyme saute par diffusion 3D : nous obtenons le bon ordre de grandeur du nombre de sauts observ´es exp´erimentalement. En outre, les cumulatives exp´erimentales et calcul´ees ont la mˆeme allure pour z > 200 nm. Notre mod`ele, `a un seul param`etre ajus-table, rend parfaitement compte de l’exp´erience. Mˆeme si cela peut paraˆıtre surprenant, les sauts correspondent `a de la diffusion `a 3D.

⋆ Il y a beaucoup de petits sauts ind´etectables : les calculs ont montr´e qu’il existait aussi des sauts inf´erieurs `a 200 nm, coupure que nous avons fix´ee `a cause des contraintes exp´erimentales. Ces (( petits )) sauts ne sont pas d´etectables dans notre confi-guration exp´erimentale mais sont en fait nombreux comme le montre la Figure III.18 : il y a en moyenne par interaction 20,5 sauts pour κ = 1,5 nm−1 et 27,1 sauts pour κ = 3 nm−1. Nous discutons de leur cons´equences dans la section suivante. De plus, la Figure III.18 nous indique que les sauts sont pour la plupart inf´erieurs `a 10 nm.

Cons´equences de l’existence des petits sauts Points expérimentaux Calculs numériques Calculs numériques

Figure III.18: Existence de petits sauts non d´etectables. Cas du Pipes pH=6,8.

Cumulatives inverses normalis´ees obtenues num´eriquement (cyan) avec le jeu de param`etres en accord avec les points exp´erimentaux (bleu) pour EcoRV-Cy3B. L’unit´e de l’axe des abscisses (taille des sauts) est la paire de base : ´echelle lin´eaire entre 0 et 10 pb, puis ´echelle logarithmique. L’ordonn´ee `a l’origine donne le nombre total N =20 de sauts invisibles.