Dispositif Exp´erimental

p N )

Figure II.24: Extension d’une mol´ecule d’ADN en fonction de la force appliqu´ee. L’´elasti-cit´e de l’ADN ´etant d´ecrit ici par le mod`ele du ver (Worm Like Chain Model, [84]).

II.4 Visualiser l’interaction ADN - EcoRV

II.4.1 Dispositif Exp´erimental

II.4.1.1 Montage de TIRFM

Les exp´eriences sont r´ealis´ees sur le montage de TIRFM sch´ematis´e sur la figure II.25. L’´el´ement principal est un microscope invers´e (IX 70, Olympus), disposant d’un objectif `a immersion `a huile de grossissement ×60 d’ouverture num´erique 1,45. En plus du laser, nous disposons d’une lampe U.V.`a spectre large, conjugu´ee avec le plan focal arri`ere de l’objectif, permettant de travailler en configuration plus classique d’´epifluorescence. Les cam´eras de d´etection sont conjugu´ees avec la lame qui est elle-mˆeme dans le plan focal de l’objectif. Les jeux de filtres (excitation, ´emission et miroir dichro¨ıque) sont adapt´es en fonction des lampes et des sondes fluorescentes utilis´ees. Une cam´era Ixon DX885 de 128×128 pixels de taille 24 µm (Andor technology) est adapt´ee sur une sortie lat´erale du microscope permettant d’acqu´erir les signaux avec une grande sensibilit´e. Une cam´era CCD classique, plac´ee au niveau de l’oculaire permet une observation en champ large sur un moniteur. Les cavit´es `a ´etirement sont plac´ees au dessus de l’objectif du microscope. II.4.1.2 Une cam´era adapt´ee au suivi de mol´ecule unique

Nous avons utilis´e une cam´era EMCCD5 (Ixon DV860), dont le principe de base est ce-lui d’un capteur CCD : les photons incidents cr´eent une paire ´electrons-trous, les ´electrons libres s’acumulent alors dans des puits de potentiel agenc´es en matrice CCD (effet

photo-5

Filtre d’émission Miroir dichroïque

Laser

ou

Lampe UV

ADN Onde évanescente

Objectif à immersion à huile

Filtre d’excitation

Figure II.25: Sch´ema du dispositif exp´erimental utilis´e pour observer les interactions ADN-EcoRV `a l’´echelle de la mol´ecule unique et en microscopie de fluorescence par onde ´evanes-cente.

Visualiser l’interaction ADN - EcoRV 0 5 10 15 5 10 15 20 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 B S σ Β

Figure II.26: D´efinition du signal `a bruit

conducteur). En pratique, le signal de fluorescence S obtenu est in´evitablement entach´e par des bruits, d’origines diff´erentes. On distingue g´en´eralement 3 principales sources de bruit :

Le bruit de photons est une propri´et´e fondamentale de la nature quantique de la lu-mi`ere. Aussi appel´e bruit quantique, il est reli´e aux fluctuations statistiques du nombre de photons incidents. L’intervalle entre chaque photon incident est r´egi par une statistique de Poisson, c’est pourquoi le bruit quantique est en √

I o`u I est le flux incident de photons. Le bruit de photons est ind´ependant de la cam´era.

Le bruit d’obscurit´e B_obs li´e aux ´electrons g´en´er´es par effet thermique au sein de la structure en silicium du CCD. Ce ph´enom`ene est ind´ependant du flux de photons incidents. Il est g´en´eralement r´eduit par refroidissement ; dans notre cas, des modules Peltier permettent de descendre le capteur `a -70◦C.

Le bruit de lecture Blect g´en´er´e par l’´electronique de la cam´era qui convertit les charges en valeur num´erique. La technologie EMCCD est une technologie d’amplification du signal avant la lecture, ce qui r´eduit le bruit de lecture, particuli`erement interessant dans le cas de signaux faibles.

Le rapport signal `a bruit SN R correspond `a l’amplitude d’un signal compar´e `a l’in-certitude sur la provenance de ce signal comme l’illustre la Figure II.26. En notant η_Q le rendement quantique de la cam´era et B_f le bruit de fond provenant de l’´echantillon mˆeme, le SN R est donn´e par la formule suivante :

SN R = ^ηQIT

p(I + Bf) ηQT + BobsT + B2 lect

(II.11) Le capteur de la cam´era est de type back-illuminated, ce qui signifie que la CCD est ´eclair´ee par l’arri`ere afin de minimiser les pertes en traversant moins de silicium. L’effi-cacit´e quantique atteint alors plus de 90 %. De plus, la cam´era dispose d’un syst`eme de frame transfert qui consiste `a diviser le registre parall`ele en deux parties identiques. La

premi`ere partie est utilis´ee pour r´ealiser l’acquisition alors que la deuxi`eme partie servira de zone de stockage temporaire. Ainsi, un transfert rapide de la totalit´e des charges de la zone d’exposition vers la zone de stockage permet de lib´erer la zone d’exposition pour une nouvelle exposition alors que la zone de stockage organise le transfert des charges vers l’amplificateur. L’acquisition a lieu en continu et le temps d’acquisition peut ˆetre descendu `a 2 ms pour une zone d’observation de 32×32 pixels. Toutes ces caract´eristiques ont permis la visualisation de fluorophores uniques.

L’ensemble des mises au point r´ealis´ees (couplage stœchiom´etrique des enzymes, pr´e-paration des surfaces, ´etirement sp´ecifique de l’ADN), nous sommes parvenus `a observer l’interaction d’une unique enzyme sur une seule mol´ecule d’ADN comme le t´emoigne le chapitre suivant.

Chapitre III

´

Etude de la diffusion facilit´ee d’EcoRV

Afin de caract´eriser la diffusion facilit´ee d’EcoRV, nous avons ´etudi´e son inter-action avec des mol´ecules d’ADN ´etir´ees ne comportant aucun site de restriction pour cette enzyme.

Dans ce dernier chapitre, nous pr´esentons d’abord le protocole exp´erimental que nous avons ´elabor´e pour observer l’interaction d’une unique enzyme EcoRV fluores-cente avec une seule mol´ecule d’ADN ´etir´ee. Ensuite, nous d´ecrirons les techniques d’analyse que nous avons mises au point pour traiter les donn´ees exp´erimentales et caract´eriser ainsi la diffusion facilit´ee de l’enzyme EcoRV. Enfin, nous proposons un mod`ele analytique qui rend compte de nos observations.

III.1 D´emarche exp´erimentale