EcoRV saute

III.3.1.1 Observations exp´erimentales

Description : sur plusieurs films exp´erimentaux d’interaction ADN-prot´eine, nous avons observ´e de longs et brefs d´eplacements de la prot´eine le long de l’ADN. Par la suite nous d´esignerons (( sauts )) ce type de d´eplacement le long de l’ADN, sup´erieur `a xC = 200 nm, en une ou deux images successives. Nous justifions ci-dessous le choix de la valeur de xC. La Figure III.10 montre un saut de 550 nm le long de l’ADN d’une enzyme marqu´ee au Cy3B qui a eu lieu en moins de tacq, la Figure III.11 est un exemple de saut de 300 nm qui a eu lieu en l’espace de 2 images sucessives (soit 2tacq).

Cons´equences : les sauts sup´erieurs `a 200 nm modifient la MSD comme le prouvent les graphes de la Figure III.12 relatifs au saut de la Figure III.10 :

– les carr´es noirs repr´esentent la MSD calcul´ee sur l’ensemble des points de la tra-jectoire en tenant compte du saut. L’ajustement lin´eaire de cette MSD donne un coefficient de diffusion de 0,18 µm2.s−1.

– les ronds rouges et bleus correspondent aux MSD calcul´ees sur les deux trajectoires secondaires obtenues en enlevant le saut (rouge : avant saut - bleu : apr`es saut). En consid´erant ces portions de trajectoires, les coefficients de diffusion obtenus sont Dav saut

1 = 3,1.10−2 µm2.s−1 et D^{ap saut}₁ = 2,6.10−2 µm2.s−1, identiques aux incerti-tudes pr`es et similaires au DPool

1 .

Lors des analyses, ce sont les coefficients de diffusion calcul´es sur les trajectoires se-condaires qu’il faut consid´erer. Par cons´equent, les grands sauts (> 200 nm) doivent ˆetre exclus des analyses. Nous verrons par la suite que les petits sauts (6 200 nm) n’inter-viennent pas dans la valeur estim´ee du coefficient de diffusion (cf. Section III.4). Dans l’´etude pr´ec´edente portant sur le sliding, n’ont ´et´e consid´er´es que les ´ev´enements d’inter-action sans sauts apparents : lorsqu’une trajectoire pr´esentait N sauts, elle a ´et´e scind´ee en N +1 trajectoires secondaires.

Crit`eres : dans nos conditions exp´erimentales, l’amplitude caract´eristique des fluctua-tions longitudinales est de l’ordre de 80 nm pour un temps caract´eristique de 1 ms (cf. Annexe C). La distance moyenne parcourue par diffusion par la prot´eine pendant le temps tacq = 20 ms est de 30 nm. Il faut aussi tenir compte de la pr´ecision de point´e σ ≈ 30 nm. Pour s’affranchir de mani`ere certaine de la composante Brownienne du mouvement et des fluctuations longitudinales de l’ADN, nous avons fix´e la limite inf´erieure de la taille des sauts `a xC = 200 nm. Pour des d´eplacements plus petits, principalement `a cause des

EcoRV saute aussi 0,8 1 ,0 1 ,2 1 ,4 1 ,6 1 ,8 -0, 3 -0, 2 -0, 1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,0 0,1 0,2 0,3 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,0 0,1 0,2 0,3 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 Y ( µm ) X ( µ m ) Saut direct MSD ( µ m ² ) Temps ( s )

MSD longitudinale après saut

Temps ( s ) MSD ( µ m ² )

MSD longitudinale avant saut

temps

Figure III.10: Un saut de 550 nm le long de l’ADN en 1 frame. Haut gauche : Haut : image de fluorescence de l’ADN marqu´e au SyBR - Dessous : extrait du film sur la mˆeme zone de l’enzyme marqu´ee `a Cy3B interagissant avec l’ADN (cercles rouges : 4 images juste avant le saut, cercles bleus : 5 images juste apr`es le saut). Haut droite : trajectoire reconstruite (X d´esigne l’axe longitudinal, Y l’axe transverse de l’ADN). Rouge : avant le saut - Bleu : apr`es le saut. Bas gauche : MSD calcul´ee sur la premi`ere partie de la trajectoire (avant saut), D₁^{av saut}= 3,1.10⁻² µm².s⁻¹. Bas droite : MSD calcul´ee sur la seconde partie de la trajectoire (apr`es saut), D₁^{ap saut} = 2,6.10−2 µm2.s−1.

Figure III.11: Un saut de 300 nm le long de l’ADN en 2 frames. La direction de l’ADN est rep´er´ee par le segment en pointill´e.

Figure III.12: Effet des sauts sur le calcul de la MSD. Si l’on inclut le saut de 550 nm de la figure III.10 dans le calcul de la MSD, nous obtenons la courbe de plus haute pente (noir) : le coefficient de diffusion calcul´e sur cette MSD est beaucoup plus ´elev´e et ne correspond plus `a celui de la diffusion 1D des enzymes. Les MSDs obtenues lorsque le saut est enlev´e apparaissent en rouge (avant saut) et bleu (apr`es saut).

EcoRV saute aussi 16 17 18 19 20 21 19,5 20,0 20,5 21,0 21,5 22,0 22,5 0 1 X Axis (pixel) ^{Y Axis} (pixel) Int e n si té : Z Axis (u.a.)

Figure III.13: Exemple de (( faux )) saut : dans cet exemple, l’enzyme saute depuis l’ADN vers la surface. L’ADN est rep´er´e par sa projection dans le plan de la lamelle (trait pointill´e). Les boules noires repr´esentent les diff´erentes positions de la prot´eine au cours du temps, les croix sont les projections de ces positions dans le plan de la lamelle. Au d´ebut (points situ´es sur la gauche de la figure), l’enzyme diffuse sur l’ADN, on devine le mouvement de diffusion et le mouvement de fluctuation ; `a la fin (points les plus `a droite), l’enzyme est coll´ee `a la surface. Ce genre de (( saut )) n’est pas pris en compte lors de nos analyses. Cet ´ev´enement permet accessoirement de mesurer la port´ee d de l’onde ´evanescente puisque l’intensit´e I est reli´ee `a la cˆote z selon : ℓn I(z1)

I(z₂) 

= ^z2− z1

d ^{. Pour cet exemple, d a ´et´e} estim´ee `a 105 nm, en accord avec la th´eorie.

fluctuations de l’ADN, il est impossible de savoir si le mouvement est du sliding ou du jumping.

Occurrence : ces sauts ont ´et´e observ´es sur environ 10% des interactions. Cependant, il n’est pas rare (1 cas sur 5) de ne pas disposer de suffisamment d’images avant et/ou apr`es ce qui apparait comme un saut : dans ce cas, nous ne pouvons savoir s’il s’agit d’un r´eel saut le long de l’ADN ou d’un saut vers et/ou depuis la surface comme illustr´e sur la Figure III.13. Par pr´ecaution, ces sauts potentiels n’ont pas ´et´e pris en compte dans les analyses.