Modélisation des structures 3D par homologie

La modélisation des structures tridimensionnelles des quatre protéines produites a été obtenue à l’aide de leurs

séquences, en utilisant les outils en ligne I-TASSER (Yang and Zhang, 2015,

https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) et Phyre2 (Kelley et al., 2015,

http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi). Les modèles utilisés sont les structures de protéines issues des familles AA10 et AA15, portant les numéros suivants dans la base de données PDB : 5FTZ (SlAA10), 4OY7 (ScAA10C), 5WSZ (BtAA10A), 5MSZ (TdAA15). La visualisation des structures a été réalisée avec le logiciel PyMol.

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Chapitre III :

Identification d’une nouvelle famille

de LPMO dans des sécrétomes fongiques

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Résumé

La première étape du projet a consisté en une étude des cocktails enzymatiques secrétés par les cinq souches sélectionnées d’Aspergillus, cultivées sur trois milieux distincts. Les 15 sécrétomes ainsi préparés ont été utilisés pour supplémenter un cocktail cellulolytique de T. reesei lors de tests de saccharification de trois biomasses prétraitées (paille de blé, Miscanthus et peuplier). L’obtention de nombreux réplicats grâce à une méthode miniaturisée robotisée a permis d’identifier les sécrétomes qui améliorent de manière statistiquement significative les rendements de saccharification de chacune des biomasses. Les performances des sécrétomes diffèrent selon les biomasses, et dépendent de la souche et du substrat utilisés pour les produire. L’analyse protéomique des sécrétomes a également montré que les 15 cocktails enzymatiques ont des compositions très différentes les unes des autres, et qu’il existe une importante diversité au sein de la plupart des sécrétomes, notamment en termes de CAZymes ; on peut noter aussi la présence de nombreuses protéines de fonction inconnue, qui laissent envisager la découverte de potentielles nouvelles activités.

Le contenu des sécrétomes ayant montré de bonnes performances de saccharification sur Miscanthus a été analysé plus en détail, ce qui a permis d’identifier une protéine de fonction inconnue, sécrétée par la souche BRFM 1490, qui possède une séquence proche de certaines LPMO tout en ne faisant partie d’aucune famille CAZy déjà existante. Il s’est avéré que cette protéine faisait partie d’une famille putative de LPMO, identifiée précédemment par analyse génomique par l’équipe CAZy et par Voshol et al. (2017), mais n’ayant pas encore de caractérisation biochimique. Une analyse bioinformatique a été réalisée, révélant que cette famille est présente chez au moins 580 microorganismes (champignons et oomycètes) ayant des modes de vie impliquant des interactions avec la biomasse végétale. L’alignement des séquences révèle de nombreux résidus conservés, dont deux histidines pouvant former l’« histidine brace » caractéristique des LPMO.

Une séquence de cette nouvelle famille, issue d’Aspergillus aculeatus a été exprimée chez Pichia pastoris, et après une mise au point des conditions de production et de purification, la protéine a été obtenue sous forme fonctionnelle, avec une histidine brace intacte contenant du cuivre. L’enzyme a été testée sur plusieurs substrats, mais n’a montré d’activité que sur la cellulose et les cello-oligosaccharides. L’utilisation de chromatographie HPAEC-PAD et de spectrométrie de masse a permis de détecter des produits de dégradation solubles, sous forme de sucres natifs et de sucres oxydés à leur extrémité C1. Des tests d’activité sur cellulose amorphe en association avec une cellobiohydrolase de T. reesei ont révélé que l’enzyme pouvait améliorer les performances de cette cellulase, ce qui pourrait avoir des applications biotechnologiques intéressantes. La nouvelle famille ainsi caractérisée a été nommée AA16 dans la base de données CAZy. Ces résultats ont été publiés en mars 2019 dans Biotechnology for Biofuels et sont présentés ici en anglais dans la forme de l’article accepté ; seule la numérotation des figures a été modifiée.

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Article 1: AA16, a new lytic polysaccharide monooxygenase family identified in fungal

secretomes

Camille Filiatrault Chastel1,2, David Navarro1, Mireille Haon1, Sacha Grisel1, Isabelle Herpoël Gimbert1, Didier Chevret3, Mathieu Fanuel4, Bernard Henrissat5, Senta Heiss Blanquet2, Antoine Margeot2 and

Jean Guy Berrin1

1 _{Biodiversité et Biotechnologie Fongiques (INRA, Aix Marseille Université), Marseille, France.}

2 _{IFP Energies Nouvelles, 1 et 4 avenue de Bois Préau, 92852 Rueil Malmaison, France.}

3 _{Plateforme d’Analyse Protéomique de Paris Sud Ouest (INRA, Agro-ParisTech), Jouy En Josas, France}

4 _{Biopolymères Interactions Assemblages (INRA), Nantes, France}

5 _{Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (CNRS, Aix Marseille Université, INRA), Marseille, France}

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Background

Lignocellulosic biomass is a renewable and abundant feedstock, considered as a promising alternative to non- sustainable fossil resources for the production of biofuels, biomaterials and bio-based chemicals (Cherubini, 2010; de Bhowmick et al., 2018). Its transformation requires an extensive deconstruction of the plant cell wall polymers, namely the cellulose and hemicellulose polysaccharides, that are intermeshed together with lignin to form a highly resistant structure. Efficient hydrolytic enzyme cocktails are therefore required but are still at the present time a major bottleneck for cost-effective industrial processes.

The degradation of plant polysaccharides into simple sugars can be achieved using enzymes secreted by biomass-degrading organisms such as bacteria and filamentous fungi. These carbohydrate-active enzymes (or CAZymes) are classified in the CAZy database (http://www.cazy.org/) into several families based on their amino acid sequence similarities (Lombard et al., 2014). Cellulases and hemicellulases, which belong to the glycoside hydrolases (GH), have been studied for more than 60 years for their ability to depolymerize cellulose and hemicelluloses. More recently, novel enzymes called LPMOs (Lytic Polysaccharide Monooxygenases) were discovered (Vaaje-Kolstad et al., 2010) and raised a high interest due to their ability to boost the hydrolysis of lignocellulosic biomass (Harris et al., 2010). LPMOs are able to cleave glycosidic bonds using an oxidative mechanism, in the presence of oxygen atoms (coming from dioxygen or hydrogen peroxide) and an extracellular electron donor (Bissaro et al., 2017; Bissaro et al., 2018). Electrons can be provided by small organic compounds such as lignin fragments and plant- or fungus-derived phenols, by enzymatic systems such as cellobiose dehydrogenase (CDH) or by photocatalytic systems (Cannella et al., 2016). All LPMOs share some common features, such as a copper-containing active site, in which the metal is coordinated by three nitrogen atoms from two histidine side chains and the N-terminal amine group that form the so-called "histidine brace" (Ciano et al., 2018; Quinlan et al., 2011).

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LPMOs are currently grouped into six CAZy auxiliary activities (AA) families (AA9-AA11, AA13-AA15), based on bioinformatic analyses of their amino-acid sequences similarities. These families are found in several taxonomic groups, and have been shown to be active on numerous substrates (cellulose, hemicelluloses, chitin and starch). The fungal AA9 family includes enzymes active on cellulose and cello-oligosaccharides, but also polysaccharides containing β-1,4 linked glucose units such as xyloglucans, glucomannans and β-glucans (Bennati-Granier et al., 2015; Fanuel et al., 2017; Isaksen et al., 2014). LPMOs from the AA10 family, which are found mainly in bacteria and some viruses, are active on both chitin and cellulose (Vaaje-Kolstad et al., 2012). AA11 and AA13 families are found exclusively in fungi; only a few of their members, which are respectively active on chitin and starch components, have been characterized so far (Hemsworth et al., 2014; Lo Leggio et al., 2015; Vu and Marletta, 2016). The fungal AA14 family was discovered recently, and two of its members showed activity on recalcitrant xylan coating cellulose fibers (Couturier et al., 2018). Finally, the discovery of the AA15 family revealed the existence of LPMOs of animal origin (invertebrates), active on both cellulose and chitin (Sabbadin et al., 2018). These enzymes have only recently been described, and the discovery of more families and new enzyme specificities can be expected.

Cellulases, hemicellulases and LPMOs are key components of industrial cocktails dedicated to biomass degradation (Johansen, 2016). The vast majority of these cocktails are based on enzymes secreted by Trichoderma reesei, a fungal species that is known for its efficient cellulolytic enzymes secretion, and benefits from decades of strain improvement (Peterson and Nevalainen, 2012; Seidl and Seiboth, 2010). However, the sequencing of its genome revealed a surprisingly small number of genes involved in polysaccharides degradation (Häkkinen et al., 2012; Martinez et al., 2008), and several missing accessory activities (Bischof et al., 2016). With only three AA9 LPMOs encoded in its genome, T. reesei has one of the smallest set of LPMOs among fungal saprotrophs, which are usually rich in AA9 with up to 40-50 genes (Lenfant et al., 2017). To compensate this lack of diversity, which may be a bottleneck for T. reesei cocktails improvement, one strategy is to upgrade T. reesei cocktails with enzymes from other biomass-degrading filamentous fungi isolated from biodiversity. Such enzymes can be found by mining the sets of secreted enzymes (i.e. secretomes) produced by fungal strains on various carbon sources, thanks to the development of protein identification tools such as LC-MS/MS and the increasing number of available annotated fungal genomes (Bouws et al., 2008; Di Cologna et al., 2017). Since a large panel of CAZymes and LPMOs are differentially secreted by fungal saprotrophs (Berrin et al., 2017; Nekiunaite et al., 2016), comparative secretomics is a promising approach to discover novel enzymes playing a role in plant biomass deconstruction. Herein, we report the identification of a new LPMO family among Aspergillus spp. secretomes improving the conversion of plant biomass. One member of this new LPMO family, termed AA16, was characterized in terms of substrate specificity, regioselectivity of oxidation and contribution to cellulose degradation.

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Results