a. Souris TCR transgéniques
i. Souris CL4 – TCR Tg
Les souris CL4-TCR (Clone-4 TCR) sont transgéniques pour un récepteur à l’antigène des LT spécifiques du peptide 512-520 de l’hémagglutinine (HA512-520) du virus influenza
restreint par la molécule de CMH de classe I, Kd (Morgan, Liblau et al. 1996). La chaîne β du transgène résulte du réarrangement Vβ8.2 - Dβ1 - Jβ1.4 et la chaîne α du réarrangement Vα10.3 - Jα34. Ce Clone-4 TCR a été obtenu via des clones CTL dérivés de souris B10.D2 préalablement immunisées avec le virus Influenza A/PR/8. L’ADN complémentaire de ce clone a été inséré dans des vecteurs TCR-α et TCR-β. Ces constructions ont ensuite été microinjectées dans des oocytes de souris fertilisée H-2bxd (C57Bl/6 x Balb/c). Cette coinjection, comme nous l’avons vu précedémment, des deux plasmides résultent en l’incorporation des deux gènes. Ces souris sont désormais maintenues par croisement sur le fond génétique BALB/c.
Chez ces souris, le rapport CD4/CD8 est inversé. On retrouve en effet 2 à 5 fois plus de LT-CD8+ que de LT-CD4+ et environ 95% de ces CD8+ sont spécifiques du peptide 512- 520. Ces LT expriment des marqueurs d’activation après stimulation in vitro avec l’antigène en présence de cellules présentatrices d’antigène et prolifèrent in vitro en réponse au peptide.
Ces souris ont été à l’origine de l’élaboration d’un modèle auto-immun spontané de diabète néonatal (Morgan, Liblau et al. 1996). Plus récemment, elles ont, entre autres, permis d’étudier le rôle des LT-CD8+ dans l’inflammation du SNC par transfert adoptif dans des souris GFAP-HA (souris transgéniques qui expriment HA sous contrôle du promoteur spécifique des astrocytes), LT-CD8+ qui peuvent induire une inflammation monophasique du cerveau chez des souris immunocompétentes (Cabarrocas, Savidge et al. 2003).
ii. Souris 6.5 –TCR Tg
Les souris 6.5-TCR sont transgéniques pour un récepteur à l’antigène des LT spécifiques du peptide 110-119 de l’hémagglutinine (HA110-119) du virus influenza restreint
par la molécule de CMH de classe II, I-Ed (Kirberg, Baron et al. 1994). La chaîne β du transgène résulte du réarrangement Vβ8.2 - Jβ2.1 et la chaîne α du réarrangement Vα4 - Jα2. Les gènes TCR-α et TCR-β réarrangés issus de l’hybridome 14.3.d spécifiques du peptide 110-119 de l’hémagglutinine du virus influenza ont été microinjectés dans des oocytes de souris fertilisée C57Bl/6 x DBA/2J. Ces souris sont maintenues par croisement sur le fond génétique BALB/c.
Chez ces souris, le TCR transgénique est exprimé à la surface des LT-CD4+ dont 20% sont spécifiques du peptide 110-119. Mais il est aussi exprimé à la surface des LT-CD8+. Ces LT expriment des marqueurs d’activation après stimulation in vitro avec l’antigène en présence d’APC et prolifèrent in vitro en réponse au peptide.
Des études récentes avec ces souris ont contribué à la compréhension du mécanisme régulateur induit par les LT, en montrant que ces souris 6.5-TCR Tg croisées avec des souris GFAP-HA développaient des mécanismes tolérogènes qui protégeaient les souris doubles transgéniques issus de ce croisement. En particulier le fait que les cellules T régulatrices issues de la souris 6.5-TCR Tg inhibaient la sécrétion d’IFN-γ produit par les LT-CD8+ spécifiques du même antigène (Cabarrocas, Cassan et al. 2006).
é
Expression de HA spécifique aux oligodendrocytes..
souris MOG x - Cre : souris Knock Insouris Knock In
Rosa 26 LoxP-STOP-LoxP-HA– – –
X
pROSA26 HA STOP loxP loxP pROSA26loxP HA CRE promoteur MOG éExpression de HA spécifique aux oligodendrocytes..
souris MOG x - Cre : souris Knock Insouris Knock In
Rosa 26 LoxP-STOP-LoxP-HA– – –
X
pROSA26 HA STOP loxP loxP pROSA26loxP HA CRE promoteur MOG b. Souris MOG-HACes souris sont des souris doubles transgéniques permettant l’expression conditionnelle de HA dans un type cellulaire spécifique, les oligodendrocytes. Elles sont issues du croisement des souris MOG-Cre où la recombinase Cre est sous la dépendance d’un promoteur spécifique (MOG) avec les souris Rosa26-HA dans lesquelles l’ADNc de HA est inséré dans le locus Rosa 26 et encadré d’une cassette STOP. Ainsi à l’issue de ce croisement, la recombinase Cre permet l’ablation de la cassette STOP au niveau des sites loxP et la souris double transgénique Rosa26-HA/Cre appelée souris MOG-HA peut initier la transcription de HA uniquement dans le type cellulaire particulier correspondant au promoteur permettant l’expression de Cre, ici MOG [figure 27].
FIGURE 27 : souris MOG-HA : réalisation d’une souris double transgénique permettant l’expression conditionnelle de HA spécifiquement dans les oligodendrocytes.
i. Souris MOG-Cre
La phase ouverte de lecture de Cre a été introduite dans le premier exon du gène MOG suivi directement par un signal de polyadénylation de l’hormone de croissance humaine. Le gène de résistance à la néomycine ainsi que le gène de la thymidine kinase ont été sélectionnés comme marqueur de sélection positif et négatif respectivement. Ainsi, des cellules souches embryonnaires (cellules ES) dérivées de souris C57Bl/6 ont été transfectées
avec le vecteur cible de manière classique. Les cellules ES qui portaient l’insertion ont été injectées dans des blastocystes CB20 pour générer les souris MOG-Cre (Hovelmeyer, Hao et al. 2005) [figure 28] . Ces souris ont été maintenues par croisement sur le fond génétique BALB/c puis par accouplement croisé afin d’obtenir des souris MOG-Cre homozygotes.
FIGURE 28 : schéma de la construction de la souris transgénique MOG-Cre
La phase ouverte de lecture de Cre a été introduite dans le premier exon du gène MOG suivi directement par un signal de polyadénylation de l’hormone de croissance humaine. Le gène de résistance à la néomycine ainsi que le gène de la thymidine kinase ont été sélectionnés comme marqueur de sélection positif et négatif respectivement. Ainsi, des cellules souches embryonnaires (cellules ES) dérivés de souris C57Bl/6 ont été transfectées avec le vecteur cible de manière classique. Les cellules ES qui portaient l’insertion ont été injectées dans des blastocystes CB20 pour générer les souris MOG- Cre
ii. Souris Rosa26-HA
Une cassette d’expression conditionnelle, englobant la phase ouverte de lecture de HA placée en 3’ d’une séquence STOP et contenant le gène de résistance à la néomycine et des sites de polyadénylation du SV40 encadrée de site LoxP a été insérée dans les sites PacI-AscI du vecteur pROSA26PA (Srinivas, Watanabe et al. 2001). Le vecteur cible a ensuite été électroporé dans les cellules ES 129SV. Deux des cellules souches ayant une recombinaison homologue correcte ont été injectées dans des blastocystes C57Bl/6. Ces souris knock-in référées comme Rosa26tm(HA)1Lib ont été croisées sur plus de sept générations sur le fond génétique Balb/c (Saxena, Bauer et al. 2008) [figure 29].
Vecteur
Locus
Locus Recombinaison homologue
FIGURE 29 : : schéma de la construction de la souris transgénique RoSA26-HA .
Une cassette d’expression conditionnelle, englobant la phase ouverte de lecture de HA placée en 3’ d’une séquence STOP et contenant le gène de résistance à la néomycine et des sites de polyadénylation du SV40 encadrée de site LoxP a été insérée dans les sites PacI- AscI du vecteur pROSA26PA (srinivas, costantini, 2001). Le vecteur cible a ensuite été électroporé dans les cellules ES 129SV. Deux des cellules souches ayant une recombinaison homologue correcte ont été injectées dans des blastocystes C57Bl/6. Ces souris knock-in référées comme Rosa26tm(HA)1Lib ont été croisées sur plus de sept générations sur le fond génétique Balb/c
iii. Souris MOG-HA
Des expériences antérieures réalisées au laboratoire ont montré chez ces souris des résultats intéressants au niveau immunologique. En effet, lorsque ces souris sont croisées avec les souris TCR transgéniques (CL4-TCR ou 6.5 TCR), une ignorance de l’antigène a été observée. Ces animaux triples transgéniques ne développent aucun signe clinique neurologique et leur profil thymique n’est pas modifié par rapport à des souris contrôles. En effet, ces souris présentent le même pourcentage et nombre absolu de lymphocytes DN, DP et SP que des souris MOG-HA.
Par contre, lorsque l’on procède à des transferts adoptifs de cellules T activées les résultats sont tout autres. Lorsque ces souris MOG-HA reçoivent des LT-CD4+ activés (culture cellulaire réalisée à partir des organes lymphoïdes des souris 6.5-TCR Tg), les animaux présentent au niveau histologique des infiltrations T dans le SNC ainsi que quelques zones d’inflammation. Lorsque ces souris reçoivent des LT-CD8+ activés (culture cellulaire réalisée à partir des organes lymphoïdes des souris CL4-TCR Tg), l’on observe alors au niveau histologique une inflammation du SNC avec une infiltration des LT et des zones de démyélinisation. Dans 30% des cas les animaux développent aussi des signes cliniques neurologiques avec une perte de poids (Saxena, Bauer et al. 2008).
OBJECTIFS
OBJECTIFSOBJECTIFS
OBJECTIFS
Dans ce contexte de l’immuno-pathologie de la SEP, ma thèse contribuera, à l’aide de différents modèles murins, à la compréhension d’une maladie auto-immune du SNC induite par les LT-CD8+.
Le modèle repose sur l’utilisation de souris transgéniques MOG-HA, souris permettant l’expression de l’Hémagglutinine (HA) du virus Influenza comme néo-auto-antigène uniquement par les oligodendrocytes et par l’utilisation de transfert adoptif de Tc1 reconnaissant spécifiquement un pepetide de HA. Ces LT-CD8+ acivés in vitro sont issus de souris CL4-TCR transgéniques.
La SEP étant une maladie multifactorielle faisant intervenir de nombreuses cellules de l’immunité tant innée qu’adaptative, mon travail de thèse s’intéresse aux influences d’autres facteurs de l’immunité adaptative sur la maladie expérimentale induite par ces Tc1.
Mon premier objectif est donc d’analyser l’influence de la population Th1, LT-CD4+ issus de souris 6.5-TCR transgéniques et activés in vitro, sur cette maladie induite par les Tc1. Cette analyse se fera tant au niveau clinique (suivi des animaux au niveau pondéral et moteur), histologique (coupes de cerveaux, moelle épinière et nerf optique) que fonctionnel (analyse en cytométrie de flux des populations infiltrantes du SNC) à différents temps de la maladie.
Mon second objectif est d’analyser l’influence des anticorps démyélinisants sur la maladie induite par les Tc1. Cette analyse se basera sur des observations histologiques à différents temps.