Les modèles d’études in vitro

I.4.1. Les réplicons subgénomiques

L’étude du cycle viral du VHC a longtemps été limitée par l’impossibilité d’infecter des cellules in vitro. Dix ans après l’identification du virus grâce au clonage de son ADNc, le développement de réplicons subgénomiques a permis d’étudier la réplication du VHC (Lohmann et al., 1999). Les réplicons sont des ARNs réplicatifs bicistroniques dont les portions codant pour les protéines structurales du VHC ont été remplacées par un gène de résistance à un antibiotique, la néomycine (gène Neo). Un IRES issu du VHC à l’extrémité 5’ permet la traduction du gène Neo, qui est suivi d’un IRES provenant du ECMV initiant la traduction des protéines non-structurales, à partir de NS2 ou de NS3 et jusqu’à NS5B (Figure 14).

Figure 14 : Structure du réplicon sub-génomique. (Boonstra et al., 2009)

Les réplicons subgénomiques sont constitués du génome du VHC délété des protéines structurales, certains étant aussi délétés pour la protéine non-structurale NS2 (flèche rouge). Ces protéines ont été remplacées par le gène de sélection Neo.

IRES, internal ribosome entry site ; Neo, gène de résistance à la néomycine ; ECMV, Encephalomyocarditis

Génome complet du VHC

Réplicon sub- génomique

Figure 13 : Modes de transmission du VHC d’une cellule infectée à une cellule naïve. (Timpe

and McKeating, 2008)

Deux modes de transmission d’une cellule à une autre ont été rapportés : la transmission du virus libre (« cell- free ») et la transmission directe de cellules à cellules (« cell-to-cell »).

Ces ARNs peuvent être transfectés dans des cellules Huh7, lignée de carcinome hépatocellulaire, qui, après sélection à la néomycine, répliquent de façon autonome l’ARN sans toutefois de production de particules virales. Ce modèle permet d’étudier la réplication virale, ainsi que de tester in vitro l’efficacité de molécules anti-virales.

L’utilisation de réplicons subgénomiques a permis de sélectionner des lignées cellulaires ayant une forte capacité de répliquer le virus. En effet, des clones dérivés de cellules Huh7 ont été transfectées avec le réplicon, puis traitées avec de l’IFN-α. Transfectées à nouveau avec l’ARN viral, elles ont supporté une plus forte réplication du virus par rapport à des Huh7 non-traitées (Blight et al., 2002). Cela a ainsi permis de générer une nouvelle lignée plus permissive à la réplication virale, nommée Huh7.5..

I.4.2. Les pseudo-particules virales (VHCpp)

En 2003, des pseudo-particules du VHC (VHCpp) ont été produites (Bartosch et al., 2003), permettant l’étude des étapes d’entrée du virus. Il s’agit de virus chimériques obtenus après co-transfection de trois vecteurs dans des cellules 293T : un plasmide codant pour les glycoprotéines d’enveloppes E1 et E2 du VHC, un second codant pour les protéines GAG et POL du virus de la leucémie murine (MLV) ou du virus de l’immunodéficience humaine (VIH), et un troisième codant pour un gène rapporteur tel que la Green Fluorescent Protein (GFP) ou la luciférase (Figure 15). Le surnageant de culture des cellules transfectées, contenant les particules virales sécrétées par les 293T, peut être utilisé pour infecter des cellules naïves, telles que des Huh7 ou des hépatocytes primaires humains (HPH). Le gène rapporteur permet de quantifier l’infection des cellules cibles par les VHCpp.

Les VHCpp infectent les cellules cibles via un mécanisme dépendant des glycoprotéines E1 et E2 du VHC, ce qui permet l’étude des étapes d’entrée du virus et de la capacité d’anticorps neutralisants à empêcher l’infection des cellules cibles. Il est possible de produire des VHCpp à partir de sérums de patients infectés par différents génotypes du VHC, afin d’étudier leur capacité d’entrée et leur susceptibilité à la neutralisation (Lavillette et al., 2005).

I.4.3. Le système de culture cellulaire du VHC (VHCcc)

En 2001, un clone particulier du VHC de génotype 2a a été isolé à partir d’un patient présentant un cas très rare d’hépatite C fulminante, qui a été dénommé JFH-1 (Japanese Fulminant Hepatitis 1) (Kato et al., 2001). Deux ans plus tard, l’ARN de ce clone a été transfecté dans des Huh7 ; cet ARN viral se réplique sans pression de sélection antibiotique, et permet directement la production de particules virales infectieuses. Le surnageant de culture des cellules transfectées contenant les particules virales peut être récupéré pour infecter des Huh7 naïves (Lindenbach et al., 2005; Wakita et al., 2005). Ce système, appelé VHCcc (culture cellulaire du VHC), a permis pour la première fois d’étudier le cycle viral complet du VHC. Par la suite, des virus exprimant un gène rapporteur tel que la luciférase ont été produits afin de détecter les cellules infectées. Aussi, des virus chimériques intra- et inter-génotypiques ont été générés (Lindenbach et al., 2005; Pietschmann et al., 2006). Le principe de ces virus chimériques consiste à remplacer les protéines structurales du JFH1 par des protéines structurales issues d’autres souches de virus, permettant d’une part d’améliorer la

Figure 15 : Stratégie de production des VHCpp. (Voisset and Dubuisson, 2004)

Les VHCpp sont généralement constituées des glycoprotéines d’enveloppes E1 et E2, d’une capside du MLV (ou du VIH) et d’un gène rapporteur codant pour la luciférase (ou pour la GFP). Après transfection de cellules 293T avec les trois plasmides, les particules virales excrétées sont utilisées pour infecter des cellules Huh7 naïves. L’infection est quantifiées par lecture de l’activité luciférase (ou par analyse de la fluorescence pour la GFP). CMV, promoteur du cytomégalovirus ; LTR, long terminal repeat ; PBS, site de fixation du primer ; PPT, séquence poly-purine

production de particules virales infectieuses et d’autre part de tester l’infectiosité de différents génotypes. Les protéines non-structurales de JFH-1 sont néanmoins nécessaires pour l’obtention d’une infection robuste par ces VHCcc.

Les particules virales générées par le système VHCcc sont infectieuses pour des cellules naïves in vitro, mais également in vivo chez des chimpanzés et chez des souris partiellement repopulées avec des HPH (Georgel et al., 2010). Cependant, des avancées techniques sont encore nécessaires pour parvenir à infecter de façon efficace les HPH in vitro, modèle cellulaire le plus pertinent.