Evaluation in vitro de l’activité anti-virale des LGM

XI.1. Modèle réplicon

Des cellules Huh7.5.1 ont été électroporées (5 pulses, 99µsec, 820V) avec un réplicon VHC (génotype 2a, isolat JFH1) délété des protéines d’enveloppe E1/E2 et codant pour la luciférase (JFH1∆E1E2-luc). Les cellules ont été co-cultivées avec des LGM à des rapports effectrices:cibles (E:C) allant de 0,125:1 à 2:1, soit de façon séparée (« transwells » ; = absence de contacts entre effectrices et cibles) soit de façon conjointe dans le même puits (= présence de contacts entre effectrices et cibles). Des cellules Huh7.5.1 seules ont été mises en présence d’IFN-γ (100ng/ml) comme témoin positif d’inhibition de la réplication virale. Trois jours plus tard, les LGM, non adhérents, ont été éliminés par lavage, et les cellules Huh7.5.1, adhérentes, ont été lysées. L’ajout de luciférine a permis de mesurer l’activité luciférase qui reflète la réplication virale au sein des cellules Huh7.5.1.

L’activité anti-virale des LGM activés par CD3/CD28 a également été testée à différents rapports E:C.

Afin d’identifier quel facteur soluble est impliqué dans l’activité anti-virale des LGM, des anticorps bloquants anti-IFN-α (Abcam, Paris, France), anti-IFN-β (Abcam), anti-IFN-γ (eBioscience) ou un anticorps isotype (eBioscience) ont été ajoutés à une concentration finale de 5µg/ml pendant la co-incubation des LGM et des cellules cibles, en co-culture à un rapport E:C de 0,5:1 ou en transwell à un rapport E:C de 2:1.

Aussi, l’activité anti-virale des fractions CD56- (cellules T) et CD56+ (cellules NK et NKT) a été testée à différents rapports E:C après avoir effectué un tri immunomagnétique des LGM comme décrit précédemment. Enfin, en raison du contexte d’immunosuppression dans lequel nous projetons d’utiliser nos LGM, la résistance de nos cellules à des inhibiteurs de calcineurine a été testée. Ainsi, les cellules Huh7.5.1 et les LGM ont été co-cultivés à un rapport E:C de 0,5:1 en présence de différentes concentrations de cyclosporine A (CsA) et de FK506 (Tacrolimus).

Pour l’ensemble des tests, des co-cultures de LGM et de cellules Huh7.5.1 ont été effectuées en parallèle afin de vérifier la viabilité des cellules cibles. Pour cela, après trois jours de co-culture, les cellules effectrices ainsi que les cellules cibles mortes ont été éliminées par lavage, puis les cellules adhérentes ont été marquées au cristal violet et l’absorbance analysée comme décrit précédemment.

XI.2. Modèle VHCcc

Le système de culture cellulaire pour le VHC (VHCcc) permettant la production des particules virales infectieuses a également été utilisé. Des cellules Huh7.5.1 ont été infectées avec du virus recombinant VHCcc Jc-1 exprimant la luciférase et des LGM ont été ajoutés, à des rapports E:C de 0,5:1 et 2:1, à différents jours post-infection. Trois jours après l’ajout des LGM, les cellules Huh7.5.1 ont été lysées et testées en activité luciférase. La viabilité des cellules Huh7.5.1 a été évaluée par marquage au cristal violet comme décrit précédemment. L’activité anti-virale des LGM activés par CD3/CD28 et des fractions CD56- / CD56+ a également été testée dans ce système à des rapports E:C de 0,5:1 et de 2:1, ainsi que la résistance des LGM aux inhibiteurs de calcineurine CsA et FK506.

XII. Prévention de l’allo-immunisation in vivo

Afin d’étudier si l’immunosuppression induite par la CsA interfère in vivo avec l’alloréactivité des LGM, des splénocytes de souris FvB-Luc exprimant stablement la luciférase ont été cultivés dans du RPMI 10% SVF contenant 5µg/mL de concanavaline A (ConA), 500U/mL d’IL-2 et 50µM de B-mercaptoéthanol, pendant 14 jours. Dix millions de ces cellules ont été injectées par voie i.p. à des souris Balb/c immunocompétentes qui ont reçu quotidiennement soit du PBS soit de la CsA (50mg/kg) ainsi que de l’IL-2 (106 UI/kg). La présence des cellules injectées est observée par mesure de bioluminescence in vivo 7 jours après l’injection, comme décrit précédemment. Parallèlement, le grade de la GvHD a été déterminé en aveugle deux fois par semaine, sur la base de cinq paramètres que sont le poids, l’intégrité de la peau, la texture du poil, l’activité et la posture des animaux (Cooke et al., 1996).

La culture des splénocytes, leur injection, le suivi de la bioluminescence et l’analyse des résultats ont été réalisés par Dr Laurent Mailly. Le grade de la GvHD a été déterminé en aveugle par Nicolas Brignon, technicien animalier.

L’alloréactivité a été décrite comme un outil extrêmement puissant d’immunothérapie anti-tumorale dans le cadre d’allogreffes de cellules souches hématopoïétiques pour le traitement des hémopathies malignes (Welniak et al., 2007). Les LGM allogéniques exprimant le gène de toxicité conditionnelle HSV-tk constituent un produit de thérapie génique (PTG) efficace en terme d’activité anti-leucémique (Ciceri et al., 2007). Extrêmement bien caractérisé et testé en clinique chez l’homme depuis près de 15 ans, son innocuité a été également pu être montrée (Bonini et al., 1997; Tiberghien et al., 2001). L’expérience clinique dont font l’objet les LGM constitue un atout majeur pour leur utilisation dans le cadre d’autres indications.

La faisabilité d’une immunothérapie cellulaire du CHC a été clairement montrée par l’utilisation d’un autre produit de thérapie cellulaire, les CIK. Ces cellules, utilisées en situation autologue, ont un effet anti-tumoral très élevé en combinaison avec les autres traitements du CHC actuellement disponibles (Takayama et al., 2000; Weng et al., 2008). Cependant, les approches autologues nécessitent une production de cellules au « cas par cas », qui est peu rentable en termes de coût et d’accessibilité du produit à grande échelle.

Notre objectif consiste à apporter la preuve de concept que les LGM allogéniques présentent une activité anti-tumorale qui en font un PTG intéressant pour le traitement du CHC, dans le but de créer une banque de LGM allogéniques « prêts-à-l’emploi ».