Modèle in vivo d’étude des propriétés immuno-modulatrices de BL dans le cadre d’une

dans le cadre d’une infection grippale

Dans le cadre de l’étude des propriétés immuno-modulatrices des souches bactériennes

sélectionnées suite aux criblages in vitro, dans le cas d’infections hivernales ; nous avons

collaboré avec l’unité de recherche en Virologie et Immunologie Moléculaire (VIM) du centre

INRA de Jouy en Josas : pour la fourniture d’un isolat particulier de virus de la grippe, le

H1N1/PR8/34 (virus grippal adapté au modèle murin) et réaliser des dosages de charge virale.

1. Inoculation virale chez la souris

Des souris BALB/c femelles (Janvier, France) ont été utilisées pour cet essai. Elles ont

été réparties en lots de 8 souris (4 souris/cage). Les expérimentations ont commencé après

deux semaines d’acclimatation des souris au sein de l’Unité d’Expérimentation Animale

Rongeurs (UEAR, INRA, Jouy-en-Josas, France) dans une cellule à atmosphère confinée, du

fait de l’utilisation du virus de la grippe. Pendant toute la durée de l'expérience, les souris

avaient un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Le protocole in vivo que nous avons mis au

point chez la souris est présenté dans la Figure 23.

Figure 23 : Protocole in vivo de l’infection virale par le virus de la grippe

Le virus de la grippe H1N1/PR8 a été produit par une culture pendant 2 jours à 35°C

dans des œufs (âgés de 11 jours) de poules fertiles. Le titre viral a été quantifié par un essai

90

sur plaque utilisant les cellules Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) et le stock viral est

gardé à -80°C pour les utilisations ultérieures.

Pour les infections intra-nasales avec le virus, les souris (âgées de 7 semaines) sont

d’abord anesthésiées par une injection intra-péritonéale de Imalgene 1000/kétamine (Merial,

France) et Rompun/xylazine (Alcyon, France) (0,1% kétamine + 0,06 % xylazine, qsp eau

physiologique). Elles sont ensuite infectées par le dépôt de 25 µl de suspension virale dans

chaque narine. Plusieurs concentrations d’inoculums viraux ont été testées : 2000, 200, 100

PFU afin d’identifier la concentration n’induisant pas de mortalité, en dehors des symptômes

visibles de la maladie.

2. Préparation des bactéries

Des cultures en phase stationnaire des souches candidates de bactéries probiotiques

ont été centrifugées à 3000g pendant 10 minutes puis les culots sont lavés dans du PBS stérile.

Le culot est resuspendu ensuite dans le PBS pour avoir une concentration finale de 1x10

UFC/souris. Les souris reçoivent quotidiennement 200 µl de cette dose bactérienne par des

administrations orales (gavages intra-gastriques) ou simplement du PBS pour les lots témoins

10 jours en préventif et 9 jours en curatif après l’infection virale. Les souris sont sacrifiées à

J10.

3. Evaluation des scores visuels

Au cours de cet essai, nous avons utilisé des marqueurs macroscopiques, qui nous

renseignent sur l’état physique des souris tout au long de l’essai. D’abord, le poids des souris

est suivi tous les jours à partir de l’infection virale. Nous avons aussi utilisé une échelle de

notation de l’état des souris prenant en compte leur aspect extérieur : 5. Saine (aucun

symptôme clinique), 4. Légère (fourrure légèrement hérissée), 3. Modérée (fourrure

modérément hérissée et léthargique), 2. Sévère (fourrure sévèrement hérissée et maigre) et 1.

Très sévère (pas de réaction à la stimulation) (Kawase, He et al. 2009). Pour l’évaluation de

ces scores en aveugle, nous avons fait appel à des binômes de notateurs extérieurs à l’essai.

4. Lavages broncho-alvéolaires

Le jour de l’abattage, les souris sont euthanasiées par dislocation cervicale. Des

lavages broncho-alvéolaires (BALF, broncho-alveolar lavage fluid) sont collectés à l’aide

d’un cône attaché à une seringue, inséré dans le partie supérieure de la trachée de la souris.

Des allers-retours sont alors pratiqués avec un volume total de 1 ml de PBS afin de laver les

91

poumons. Les BALF sont congelés à -80°C jusqu’à leur utilisation. Des dosages d’Ac (IgA

totaux, IgM totaux, IgE totaux, IgG1 spécifique au virus, IgG2a spécifique au virus et IgA

spécifique au virus) sont réalisés. Les dosages des Ac totaux (IgA, IgM et IgE) ont été

effectués à l’aide de kits ELISA (Mabtech, Sweden). Les dosages des Ac spécifiques au virus

ont été faits avec un protocole ELISA adapté, comprenant notamment une étape de coating

des plaques avec des protéines virales et l’utilisation d’Ac anti-IgG1, IgG2a ou IgA

(BD-Pharmingen, France) conjugués à une peroxydase.

5. Dosage de la charge virale

Les poumons sont ensuite prélevés et congelés dans l’azote liquide, puis conservés à

-80°C. Un morceau de quelques milligrammes de poumons est broyé en présence de tampon

de lyse (RLT+ mercaptoéthanol) et de billes en céramique de diamètre 1 mm (dans le

laboratoire P2 de la VIM). L’extraction de l’ARN total à partir des poumons des souris est

ensuite effectuée avec le Qiagen RNeasy mini kit (Qiagen, France). Les ARN sont ensuite

traités avec la DNase I et la concentration en ARN total est dosée avec un NanoDrop(Thermo

Fisher Scientific, USA). Une reverse transcriptase est réalisée avec la superscript II reverse

transcriptase (Invitrogen, USA) et l’amorce M1: 5’-TCT AAC CGA GGT CGA AAC

GTA-3’ à partir de 2,5 µg d’ARN total selon les indications du fournisseur. Une Polymerase Chain

Reaction (PCR) quantitative est finalement réalisée avec le mix PCR Quanti Tect SYBR

Green PCR Kit (Applied Biosystems, USA), les amorces spécifique du virus H1N1 PR8/34:

M1 (sens: 5’-AAG ACC AAT CCT GTC ACC TCT GA-3’; anti-sens: 5’-CAA AGC GTC

TAC GCT GCA GTC C-3’) et l’appareil Mastercycler realplex (Eppendorf, France) (Le

Goffic, Bouguyon et al. 2010). Les conditions d’amplification sont les suivantes : 10 minutes

à 95°C, 40 cycles (15secondes à 95°C, 20 secondes à 64°C et 30 secondes à 72°C), 15

secondes à 95°C, 15 secondes à 60°C, 20 minutes de melting curve et 15 secondes à 95°C.

La quantification est réalisée par comparaison à une gamme étalon virale établie à partir d’un

plasmide contenant la séquence du gène cible (capside) des amorces utilisées.

6. Analyses statistiques

Les comparaisons entre les différents résultats obtenus ont été analysées par le logiciel

GraphPad Prism5 ®. Les différences sont considérées comme significatives si P est < 0,05.

92