Vers une forme active de la protéine.
I. Un modèle pour la forme active.
1) Comparaison dans les banques de données structurales
A ce jour, la structure de la forme active de la protéine PerR, contenant le métal de régulation, n’a pas été résolue. Cependant, des essais de modélisation basés sur la structure de la forme PerR-Zn et celle de la protéine Fur de Pseudomonas aeruginosa, ont permis d’établir un modèle pour la forme active PerR-Zn-M (M=Fe2+ ou Mn2+). L’algorithme DALI (Distance
matrix ALIgnment) a été utilisé pour réaliser des comparaisons structurales entre PerR-Zn et
les structures disponibles dans la Protein Data Bank (PDB). La protéine Fur de P. aeruginosa a été déterminée comme le plus proche homologue structural de PerR.
- 146 -
2) Structure cristallographique de la protéine Fur de P. aeruginosa
Pohl et al. ont cristallisé la forme métallée en excès de Zn2+ de la protéine Fur de P.
aeruginosa (Pohl et al., 2003). La structure obtenue est un dimère de 2*134 résidus contenant
une glycine et une sérine supplémentaires à l’extrémité N-terminale. La présence de ces résidus est due à la construction plasmidique utilisée. Pohl et al. ont construit une protéine de fusion avec la Glutathion S-transférase (GST, fusionnée en N-terminal de Fur). Après purification, la GST est clivée par la thrombine mais une glycine et une sérine supplémentaires restent présentes à l’issue de la protéolyse. Des cristaux ont été obtenus avec cette protéine et ont permis de résoudre sa structure. La protéine Fur de P. aeruginosa est constituée de deux domaines (Figure III.1) :
• un domaine C-terminal permettant la dimérisation (résidus 85 à 147). L’interface de dimérisation est constituée d’un long feuillet β antiparallèle (12 résidus) regroupant les brins
B5/B5’ et les hélices H5/H5’. Cette interface est stabilisée par l’interaction de résidus hydrophobes qui sont conservés dans les différents organismes au sein de B5 (motif LYLY) et H5 (I113).
• un domaine N-terminal (résidus 1 à 84) contenant le motif de liaison à l’ADN de type hélice-coude-hélice ailé. Ce motif contient notamment l’hélice H4 d’interaction avec l’ADN. La structure montre que les hélices H4 et H4’ sont orientées de manière perpendiculaire permettant leur interaction avec l’ADN.
Figure III.1 : structure cristallographique du dimère Fur de P. aeruginosa ayant incorporé du zinc dans le site
régulateur. Une sous-unité est représentée en magenta. Dans l’autre sous-unité, le domaine de liaison à l’ADN est représenté en rouge et le domaine de dimérisation en vert. Le zinc du « site structural » est représenté en bleu
et celui du « site régulateur » en rouge.
H5 et H5’ B5 et B5’ H5 et H5’ B5 et B5’ H4 H4 H4 H’4 H4H4H4H4 H4 H’4 H4 H’4
- 147 -
Les sites métalliques de la protéine ont été identifiés par XAS (X-ray Absorption Spectroscopy) en dialysant la protéine purifiée contre du tampon contenant du Fe(II) (Figure III.2) (Pohl et al., 2003). Cette technique a permis d’identifier la présence de Zn2+et de Fe2+ dans l’échantillon. Comme le Zn2+ n’a pas été utilisé durant la purification, les auteurs en ont
déduit qu’il existe un site à zinc déjà occupé dans la protéine. De plus, le zinc ne pouvant pas être échangé par du Fe2+ lors de la dialyse, les auteurs ont conclu qu’il s’agit d’un site de
haute affinité pour le Zn2+. Les études spectroscopiques (XANES, X-ray Absorption Near- Edge Structure et EXAFS, Extended X-ray Absorption Fine Structure) ont montré que ce site
à zinc est tétraédrique ce qui appuie l’identification de ce site comme le site structural. Les ligands proposés pour le zinc sont les résidus His32, Glu80, His89 et Glu100. Ces études ont également montré que le site contenant le Fe2+ contient 5 ou 6 ligands de type azote ou oxygène. Les auteurs en ont donc déduit qu’il s’agit du site régulateur. Dans ce cas, les ligands proposés pour le fer sont les résidus His86, Asp88 (ligand bidentate), Glu107, His124 ainsi qu’une molécule d’eau.
Figure III.2 : sites métalliques de Fur de P. aeruginosa d’après la structure cristallographique et les données
XAS. A) Site structural B) Site régulateur.
Cependant, la nature de ces sites métalliques a récemment été remise en question. Les résidus proposés par E. Pohl comme étant les résidus du site de régulation de Fur de P.
aeruginosa sont conservés chez Fur de Bradyrhizobium japonicum. Cette dernière a été mutée
au niveau de ces résidus et les mutants correspondants sont toujours capables de lier le métal de régulation (Friedman & O'Brian, 2004). De plus, une étude récente a montré que les histidines 32 et 89 de Fur de P. aeruginosa sont essentielles pour la liaison du métal de régulation, in vivo, et donc pour l’activité de la protéine (Giedroc & Arunkumar, 2007) alors qu’elles ont été proposées comme ligands du zinc structural par le groupe de E. Pohl. Il
- 148 -
apparaît donc que ce groupe s’est trompé et que le site proposé comme étant le site structural corresponde en fait au site de régulation. Sa configuration tétraédrique serait très probablement induite par la liaison du zinc (qui a été ajouté en excès lors de la purification) alors que la liaison du fer entraînerait une géométrie différente mais indéterminée à ce jour (Giedroc & Arunkumar, 2007).
3) Hypothèse pour la forme active de PerR
Des comparaisons structurales effectuées avec les domaines N-terminal et C-terminal de PerR, pris séparément, ont montré que les plus proches homologues sont respectivement les domaines N-terminal et C-terminal de la protéine Fur de P. aeruginosa. A partir de cette observation, un modèle de la forme active de PerR a été réalisé en superposant les domaines N-terminal et C-terminal des deux protéines (Figure III.3).
Figure III.3: représentation de la forme active du dimère de PerR avec les deux hélices H4 en rouge. Les atomes
de zinc sont en marron. Les cinq résidus du site potentiel de régulation sont également indiqués.
Ce modèle de la forme active de PerR présente la protéine sous forme d’une « pince ». Il est obtenu en réalisant une rotation de 160° du domaine C-terminal par rapport au domaine N-terminal de la forme PerR-Zn. Logiquement dans cette configuration, l’homologie avec la
- 149 -
protéine Fur de P. aeruginosa est très forte. Les hélices H4 de chaque monomère de PerR sont alors positionnées de façon analogue à celles de la protéine Fur et donc idéalement placées pour interagir avec l’ADN.
4) Un site potentiel de régulation
Ce modèle permet, par ailleurs, de mettre en évidence un site potentiel de coordination pour le métal de régulation (Figure III.4). Il est composé de cinq acides aminés (His 37, 91, 93, et Asp 85, 104) conservés chez les membres de la famille de PerR (Figure III.5).
Figure III.4 : zoom du site potentiel de régulation mis en évidence par la rotation de 160° du domaine C-terminal
par rapport au domaine N-terminal aboutissant à la forme active de PerR.
Figure III.5 : alignement des séquences des protéines PerR-like au niveau des ligands potentiels du métal de
régulation (Sau Streptococcus aureus ; Cje Campylobacter jejuni ; Spy Streptococcus pyogenes ; Sco
Streptococcus coelicolor ; Sre Streptococcus reticuli ; Bsu Bacillus subtilis).
Ce site est en accord avec les résultats récents du groupe de J.D. Helmann qui a montré par des expériences de mutagenèse dirigée que ces cinq acides aminés sont essentiels