A partir de la structure cristallographique de la protéine apo-PerR-Zn (forme inactive), nous avons proposé un modèle de la forme active. Dans ce modèle, après un réarrangement structural, la protéine adopte une conformation en forme de « pince » capable d’interagir avec l’ADN grâce à ses deux hélices H4. La fixation du métal régulateur permet d’obtenir et de stabiliser cette conformation. Afin de valider ce modèle, l’étude des changements structuraux de la protéine en solution, lors de la métallation en absence ou en présence d’ADN, a été entreprise grâce à la spectroscopie de fluorescence. Dans ce but, des résidus tryptophane ont été introduits, par mutagénèse dirigée, au sein de la protéine PerR pour jouer le rôle de sondes structurales. La protéine PerR ne contenant pas d’autres résidus tryptophane, toute modification dans le spectre d’émission de fluorescence reflète un changement dans l’environnement du tryptophane.
Deux mutants de la protéine ont été synthétisés : PerR-Y44W et PerR-Y77W. Chacun contient un unique résidu tryptophane dont l’environnement est susceptible d’être modifié lors de la métallation de la protéine et de la formation du complexe ADN-protéine. Les expériences réalisées avec le mutant PerR-Y44W ont montré que celui-ci ne permet pas de suivre la métallation de la protéine et la formation du complexe ADN-PerR. Par contre, la métallation du mutant PerR-Y77W entraîne une baisse de l’intensité de fluorescence. Ce résidu W77, qui se trouve au sein d’une boucle flexible de la protéine, voit donc son environnement modifié lors du passage de la forme inactive à la forme active de PerR. Ce résultat, cohérent avec nos hypothèses structurales, va donc dans le sens d’un réarrangement conformationnel de la protéine en solution. Dans la forme métallée de PerR, ce tryptophane se trouve alors plus proche des résidus des feuillets β du domaine de dimérisation de la protéine.
Ces résidus sont probablement responsables de la diminution de l’intensité de fluorescence en absorbant une partie de l’énergie émise par le tryptophane suite à son excitation. Cependant, la technique utilisée ne permet pas de déterminer avec précision quels sont les acides aminés responsables de cette diminution d’intensité. Le comportement de PerR-Y77W, en présence d’ADN, est également intéressant. En effet, nos expériences ont montré une augmentation de l’intensité de fluorescence après l’ajout de métal. Comme nous l’avons mentionné précédemment, cette augmentation est due à la fixation de la protéine sur l’ADN. Lors de la formation du complexe ADN-protéine, l’environnement du résidu W77 est également perturbé. L’augmentation de la fluorescence indique que certains acides aminés qui absorbaient une partie de l’émission de fluorescence se sont éloignés. Cependant, ce résultat
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reste qualitatif et il est difficile d’en tirer des informations plus précises au niveau moléculaire. Comme nous l’avions prévu, le mutant PerR-Y77W constitue une sonde structurale permettant de suivre le changement de conformation de la protéine suite à sa métallation. Il permet aussi, de manière inattendue, d’affirmer que la conformation de la protéine est également modifiée lorsque celle-ci se fixe à l’ADN. L’ensemble de ces résultats suggère que la protéine PerR existe, in vitro, sous trois formes en solution : la forme apo PerR-Zn, la forme métallée « libre » PerR-Zn-M et la forme métallée complexée à l’ADN.
La spectroscopie de fluorescence nous a donc permis de mettre en évidence les changements de conformation de la protéine en solution. Ce résultat va dans le sens du modèle structural proposé pour la forme active de PerR. La protéine adopte ainsi une conformation en « pince » permettant son interaction avec sa séquence de reconnaissance.
En perspective à ce travail, le mutant PerR-Y77W pourra être utilisé pour suivre le comportement de la protéine liée à l’ADN après réaction avec H2O2. En effet, in vivo, dans les
conditions normales, PerR est liée à l’ADN au niveau de sa séquence cible. Lorsqu’elle réagit avec H2O2, la protéine se décroche très probablement suite à l’oxydation d’un ou plusieurs
résidus du site actif et à la perte du métal de régulation. La dissociation du métal de régulation provoque alors un changement de conformation qui abolit les contacts entre les nucléotides et les acides aminés. La dissociation du complexe PerR-ADN entraînera une modification de l’environnement du tryptophane 77 et donc une modification de son émission de fluorescence. A ce jour, les données cinétiques de la dissociation du complexe ADN-PerR en présence d’H2O2 n’ont pas été déterminées. De manière analogue à la protéine OxyR, ces données
pourraient être obtenues en utilisant les propriétés d’un résidu tryptophane en spectroscopie de fluorescence. En effet, à partir de la variation de l’intensité de fluorescence du résidu W175 d’OxyR, Lee et al. sont parvenus à déterminer une constante de vitesse égale à 4,9 s-1 qui correspond au réarrangement structural de la protéine provoqué par la formation du pont disulfure intramoléculaire entre les cystéines C199 et C208 en présence d’H2O2 (Lee et al.,
2004).
Dans le cas de PerR, il serait intéressant de déterminer la cinétique de décrochage de l’ADN liée à l’oxydation de la protéine au niveau de son site de régulation. Dans ce cas, les expériences de réactivité du PerR-Y77W avec H2O2 seront réalisées avec la forme PerR-
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