A. Mise au point du dosage des IgA2 anti-allergène à partir du modèle TNF-α
Pour la mise au point de la méthode de dosage des IgA2 spécifiques, nous avons utilisé le
modèle IgA2 anti-TNF-α pour lequel nous disposions de réactifs et de différents contrôles
nécessaires à la validation de celui-ci.
Le mode opératoire était semblable à celui du schéma présenté figure 6, avec une adaptation
des réactifs. Les ImmunoCap® TNF-α n’étant pas commercialisés, nous avons utilisé des
ImmunoCap® streptavidine permettant l’accrochage du TNF-α biotinylé sur le cap. Cette étape
était réalisée manuellement suivie d’une incubation de 30min à 37 °C.
Cette technique avait l’avantage de pouvoir valider la spécificité de l’Ac anti-IgA2 grâce à
l’IgA2 anti-TNF-α d’une part, et de réaliser une gamme de calibration propre aux IgA2
spécifiques d’autre part.
L’utilisation de témoins négatifs pour la mise au point de la méthode était essentielle pour
prouver la spécificité de l’Ac anti-IgA2. Ceux-ci étaient de deux types : IgA1 anti -TNF-α et
IgA2 anti-CD20. Le premier permettait de vérifier que l’Ac anti-IgA2 ne reconnaissait pas le
fragment Fc de l’IgA ; sachant que les fragments Fc des IgA1 et IgA2 ne différent que de
quelques acides aminés. Quant à l’IgA2 anti-CD20, il permettait de vérifier qu’il n’existait pas
de fixation non spécifique de l’IgA2 avec le complexe cap streptavidine-TNF-α biotinylé.
1. Sensibilisation des caps streptavidine avec du TNF-α biotinylé
Nous avons commencé par tester la sensibilisation des caps streptavidine en utilisant différentes
quantités de TNF-α biotinylé : 0 µg, 0.05 µg, 0.2 µg, 0.5 µg, 2 µg, 5 µg /cap. Afin d’optimiser
cette étape, la concentration en IgA2 anti-TNF-α était de 0.1µg /mL. Cette concentration a été
fixée pour la phase de sensibilisation et a été choisie afin d’être compatible avec la gamme de
mesure des IgE spécifiques de TFS.
En effet, la méthode de dosage des IgE spécifiques par TFS utilise une gamme de calibration
allant de 0.1 à 100 kUA/L avec UA correspondant à unité arbitraire. Le dosage des IgE
spécifiques est extrapolé à partir de la gamme d’étalonnage des IgE totales. Ces dernières sont
exprimées en unités internationales kU/L, où une unité (U) d’IgE est définie par le standard
international WHO75/502 comme correspondant à 2.42 ng d’IgE.
Il est à noter que depuis 2006, le seuil de détection des IgE spécifiques, déterminé par TFS, est
de 0.1kUA/L.
Ainsi nous pouvons conclure que la détection des IgE spécifiques varie de 242 ng/L de 0,242
mg/L. Par ailleurs, l’IgG1 de souris anti-IgA2 à la concentration de 5 µg/mL a été ajoutée en
excès par rapport à l’IgA2 anti-TNF-α et directement diluée dans l’échantillon contenant
l’IgA2 anti-TNF-α et du tampon phosphate salin (PBS). Enfin, l’Ac anti-IgG de souris couplé
à la β- galactosidase a été ajouté au 1/500ème selon les concentrations préconisées par le
fournisseur. Le blanc ne comportait pas de TNF-α.
Les résultats de la mesure des IgA2 anti-TNF-α présentés figure 8 montrent un signal plus
important aux alentours de 0.2 et 0.5µg /cap.
Figure 8 : Détermination de la quantité de TNF-α pour la sensibilisation des caps streptavidine. Des
concentrations croissantes de 0,05 à 5 µg de TNF-α par cap ont été testées. Les résultats sont exprimés
en fonction du signal de fluorescence IgA2 anti-TNF-α obtenu en Unité Arbitraire (UA) pour lequel le
signal du bruit de fond a été soustrait.
Les concentrations ont donc été resserrées autour de la quantité de 0.5 µg/cap : 0.1 µg, 0.2 µg,
0.3 µg, 0.6 µg et 1 µg de TNF-α/cap (Figure 9).
Figure 9 : Détermination de la quantité de TNF-α pour la sensibilisation des caps streptavidine. Des
concentrations croissantes de 0,1 à 1 µg TNF-α par cap ont été testées. Les résultats sont exprimés en
fonction du signal de fluorescence IgA2 anti-TNF-α obtenu (UA) pour lequel le signal du bruit de fond
a été soustrait.
Le signal optimal a été retrouvé à la concentration de 0.1 µg de TNF-α/cap. Cette
concentration a donc été retenue pour la sensibilisation des caps dans les expériences
suivantes.
2. Saturation des caps streptavidine
Le bruit de fond étant important dans les expériences précédentes réalisées dans du PBS, nous
avons testé une étape supplémentaire de saturation en ajoutant des protéines permettant la
saturation des caps. Celle-ci a été réalisée avec deux agents saturants différents, d’une part avec
du PBS contenant 5% d’albumine et d’autre part avec du PBS contenant 5% de sérum humain
normal. L’IgA2 anti-TNF-α était ajoutée à la concentration de 0,1 µg/mL, l’Ac primaire à
5µg/mL et l’Ac secondaire à la concentration préconisée par le fournisseur.
L’analyse des résultats de la figure 9 montre que la saturation en présence de sérum humain
normal inhibe la réaction enzymatique alors que l’albumine préserve le signal. Le signal à 0.1
µg de TNF-α/cap en PBS seul est inférieur à 1000 UA alors qu’il est supérieur à 10000 UA en
présence d’albumine. De plus, par comparaison avec le PBS seul (Figure 10), nous observons
un meilleur signal en présence d’albumine. En effet à la concentration de 0.1µg de TNF-α/cap
et en diluant les IgA2 anti-TNF-α dans du PBS seul nous obtenons un signal de 3750 UA
alors qu’il est de 10 000 UA en présence de PBS-albumine. La présence d’un point aberrant à
la concentration de 0.2 µg de TNFα/cap sur la courbe PBS-albumine était liée à une bulle
dans l’échantillon, celui-ci a donc été supprimé de la figure 10.
Figure 10 : Effet de la saturation des caps par de l’albumine ou du sérum humain sain. Les résultats
sont exprimés en fonction du signal de fluorescence IgA2 anti-TNF-α obtenu (UA) pour lequel le
signal du bruit de fond a été soustrait.
En conclusion, la saturation avec du PBS-albumine 5% améliore le signal détectable. Il sera
donc utilisé comme tampon de dilution pour une sensibilisation de 0.1µg/cap en TNF-α
biotinylé pour les manipulations suivantes.
3. Détermination de la concentration en Anticorps anti-IgA2
La troisième étape visait à déterminer la concentration optimale en IgG1 anti-IgA2. Les
différentes concentrations en Ac anti-IgA2 ont été établies avec pour objectif d’être supérieur
à la concentration maximale en IgA2 anti-TNF-α. Les deux concentrations testées étaient
(Figure 11) :
-Ac anti-IgA2 à 1 µg/mL
-Ac anti-IgA2 à 5 µg/mL
Figure 11 : Variation du signal obtenu en fonction des concentrations d’IgA2. Les concentrations
de 5µg/mL (courbe rouge) et 1µg/mL (courbe bleue) d’Ac anti-IgA2 ont été testées. Les signaux de
fluorescence (UA) présentés sur une échelle logarithmique correspondent aux signaux pour lequel le
signal du bruit de fond a été soustrait.
La concentration donnant le meilleur signal est celle de 5µg/mL d’Ac anti-IgA2. Cependant,
il est difficile de savoir si la phase de saturation était atteinte avec cette concentration. Afin de
le vérifier, nous avons effectué un dosage en comparant une concentration en Ac anti-IgA2
égale à 5 µg/mL et une concentration nettement supérieure, 25μg/mL. La concentration en
IgA2 restait fixe à 0.1μg/mL. Le signal obtenu en unité arbitraire ne variait que de 1,2% entre
les deux concentrations d’Ac anti-IgA2. Nous avons estimé que cette variation était
négligeable et devant le prix du réactif nous avons gardé la concentration d’Ac anti-IgA2 de
5µg/mL.
4. Gamme de calibration
Nous avons voulu mettre au point une gamme de calibration à partir de ce modèle. Il fallait,
pour utiliser la méthode de dosage des IgE spécifiques, trouver une gamme avec des valeurs
proches de celles utilisées par TFS allant de 0,242 ng/mL à 0,242 µg/mL. Six points de gammes
en IgA2 anti-TNF-α ont été déterminés, en utilisant des dilutions en cascade de facteur 10 en
partant d’une concentration égale à 0,1µg/mL. Cette gamme a été a répétée plusieurs fois mais
n’a pas pu être mise en place car, les points de gammes inférieurs à 0,1µg/mL donnaient des
signaux confondus dans celui du bruit de fond. Ces six points de gamme ont été testés avec
les témoins de spécificité, l’IgA2 anti-CD20 et l’IgA1 anti-TNF-α. Le signal retrouvé pour
ces six points était toujours au niveau du bruit de fond, y compris pour la concentration
maximale de 0,1μg/mL d’IgA2 anti-TNF-α.
En conclusion, cette première partie sur la mise au point du dosage des IgA2 dans le modèle du
TNF-α nous a permis de valider la spécificité de nos réactifs. Nous avons principalement montré
la spécificité de l’IgG1 de souris anti IgA2 humaine ce qui est primordial pour le dosage des
IgA2 spécifiques chez les patients. Seule la courbe de calibration n’était pas reproductible dans
ces conditions. De ce fait le dosage semi-quantitatif n’a pas pu être mis en place par manque de
temps.
Dans le document
Anne GATIGNOL DOCTORAT EN MEDECINE Thèse
(Page 39-44)