Mise en évidence d’une co-localisation des protéines d’intérêts

La technique du Duolink® nous permet de visualiser in situ, la co-localisation de protéines grâce à une technologie de ligation de proximité. Lorsque deux protéines sont à une distance de moins de quarante nanomètres, un signal de fluorescence est émis.

Quatre couples de protéines ont été choisis suivant la littérature et la nature des anticorps utilisées : la moesin avec soit la protéine PKA, soit le transporteur MRP4, ou la phosphodiestérase puis un dernier couple formé de l’adénylate cyclase et la PKA (figure 24).

Figure 24. Mise en évidence d’une co-localisation entre différents acteurs de la voie de signalisation de l’AMPc.

(A) Après fixation de plaquettes au repos, les anticorps primaires d’espèces

différentes (lapin ou murins) sont incubés suivant les couples choisis (1 heure, 37°C en chambre humide). Après plusieurs lavages, les anticorps secondaires couplés à des sondes PLA PLUS ou PLA MINUS sont incubés (1 heure, 37°C en chambre humide) suivi des étapes de ligation et d’amplification. Si les protéines sont colocalisées un signal (vert) est émis. Pour finir, la phalloïdine, marqueur de l’actine polymérisé, est incubée 20 min, à température ambiante (rouge). (B) agrandissement d’une ou deux

plaquettes de la figure A représentant les couples d’anticorps choisis plus la phalloïdine. Echelle de 2 µm. Photos représentatives de 2 expériences réalisées en duplicate.

Cette technique montre une co-localisation de certains acteurs de la voie de signalisation de l’AMPc. Lorsque les plaquettes sont au repos, nous observons une co-localisation de l’adénylate cyclase et la PKA-RI, ainsi que de la moesin avec la PDE2A d’une part et la PKA-RI d’autre part. Cependant, toutes les plaquettes visualisées dans différents champs n’ont pas de marquage. Pour le couple adenylate cyclase/PKA, 21% (10/48 plaquettes) possèdent un marquage et les couples PKA/moesin et PDE2A/moesin ont respectivement 26% et 44% de plaquettes marquées.

De plus, nous observons des marquages d’intensités très variables, au sein d’une même plaquette (figure 24B) et d’une plaquette à l’autre (figure 24A). Par ailleurs, les signaux (vert-jaune) ne semblent pas répartis de façon homogène dans la cellule, ce qui pourrait correspondre à une co-localisation de ces protéines plus importante au sein des microdomaines.

Concernant le couple MRP4/moesin, le marquage, reflet d’une co-localisation de ces 2 protéines, est faible aussi bien au niveau de l’intensité du signal (fluorescence très faible) qu’au niveau du nombre de plaquettes marquées (8%).

Discussion

La compartimentation cellulaire joue un rôle crucial au sein des cellules, elle régule de façon spatio-temporelle les évènements cellulaires en localisant spécifiquement des molécules. Il s’agit d’un mécanisme dynamique qui, selon les conditions de stimulation ou d’inhibition, rapproche et éloigne les acteurs d’une voie de signalisation. Dans les années 80, un nouveau concept de compartimentation voit le jour : l’existence de radeaux lipidiques, appelés aussi les microdomaines membranaires (Karnovsky et al. 1982). Ces structures très dynamiques et enrichis en stérols permettent l’association et la dissociation de complexes moléculaires et participent ainsi à la régulation de voie de signalisation.

A ce jour, leur présence et leur rôle crucial dans la voie de la signalisation de l’AMPc ont été démontrés dans différents types cellulaires notamment dans les cardiomyocytes (Berthouze et al. 2011). En revanche, peu de données existent dans les plaquettes alors que la voie de l’AMPc est la voie principale de l’inhibition plaquettaire.

Le but de cette étude a donc été, dans un premier temps, de mettre en évidence le rôle des microdomaines dans l’activation plaquettaire controlée par la voie de l’AMPc, puis dans un deuxième temps, de caractériser ces microdomaines.

Afin d’étudier le rôle des microdomaines dans l’activation plaquettaire, des tests d’agrégation plaquettaires au PAR1-ap en présence ou absence de MCD (perturbateur des microdomaines) ont été réalisés. Les résultats montrent un effet inhibiteur, dose dépendant du MCD sur l'agrégation plaquettaire et suggèrent ainsi un rôle des microdomaines dans l'activation des plaquettes. Afin de définir par quel mécanisme les microdomaines régulent l'activation, nous avons exploré la voie de l'AMPc par l'ajout de forskoline aux suspensions plaquettaires pré-incubés par du MCD ou du tampon. La forskoline, en activant l'adénylate cyclase, augmente la concentration d'AMPc dans les plaquettes. Pour cette étude, nous avons choisi d’utiliser une concentration de forskoline qui, en absence d’autres inhibiteurs de l’agrégation, n’est pas suffisante pour induire une inhibition de l'agrégation plaquettaire au PAR1-ap. En revanche, lorsque les plaquettes sont pré-incubées avec une faible dose de MCD (responsable d'une inhibition minime de l'agrégation) l'association de la forskoline

entraine une diminution significative de l'agrégation. Ainsi, l'activation de l'adénylate cylcase et la destruction des microdomaines ont un effet synergique sur l'inhibition plaquettaire.

Notre hypothèse est que les microdomaines "séquestreraient" l'AMPc, le rendant nondisponible pour agir sur tous ces effecteurs et maintiendraient la balance entre repos et activation plaquettaire, empêchant une trop forte inhibition plaquettaire. Lors de l'augmentation de la concentration d'AMPc, ce dernier serait retenu localement par les microdomaines mais au-delà d'une certaine concentration cette régulation serait saturée. Ainsi en l'absence de microdomaines, lors de l'ajout de la forskoline, une inhibition de l’agrégation sera observée dès les premières molécules d'AMPc synthétisées.

Les microdomaines, de par leurs compositions, sont insolubles dans les détergents doux et ont une faible densité. Grâce à ces caractéristiques spécifiques et à l’aide de la littérature, nous avons mis au point, au sein de notre unité, la technique d’isolement des microdomaines. Chaque étape de la technique est critique que ce soit la lyse des échantillons, la préparation des gradients, le choix de la centrifugation ou la précipitation des protéines, ainsi de nombreux paramètres ont dû être validés au cours des différentes expériences.

Après avoir mis en évidence le rôle fonctionnel des microdomaines sur l'agrégation plaquettaire, la deuxième partie de mon projet a été de les caractériser. Une grande partie de mon travail a été consacré à la mise au point de la technique d’isolement des microdomaines plaquettaire. Cette technique d’isolement, basée sur une ultracentrifugation de gradient de sucrose, a pu être élaborée grâce aux caractéristiques spécifiques des microdomaines (notamment leur flottabilité) mais également grâce à la littérature. En effet, de nombreux travaux existent concernant l’isolement des microdomaines, toutefois, ces techniques d’isolement doivent être optimisées afin d’améliorer leur reproductibilité mais doivent également s’adapter aux différents types cellulaires. De nombreux paramètres ont donc été testés, notamment les marqueurs des microdomaines ou la protéine LAT et syk ont été choisi pour marquer respectivement la présence et l’absence des microdomaines par western blot. Les résultats préliminaires présentés dans ce rapport ont été obtenus avec le protocole qui nous a donné le meilleur isolement des microdomaines (c’est à dire une nette

séparation des protéines, marqueurs des microdomaines, avec les autres protéines hors microdomaines) et une bonne répétabilité.

Nous nous sommes intéressés aux protéines d’intérêt dans la voie de l’AMPc. Il s’agit de l’enzyme responsable de sa synthèse (l’adénylate cyclase), de son effecteur principal (la PKA), et des enzymes l’hydrolysant (les phosphodiesterases). Les isoformes de l’adénylate cyclase présentes dans les plaquettes sont les AC III, V et VI et concernant les phosphodiesterases hydrolysant l’AMPc, il s’agit de la PDE2, et de la PDE3a (Smolenski 2012). Une autre catégorie d’acteurs importants de la voie de l’AMPc sont les protéines appartenant à la famille nommée AKAPs. En effet, ces protéines d’ancrages sont responsables d’une régulation spatiotemporelle des réponses cellulaires dépendantes de la voie de l’AMPc. Elles possèdent toutes un domaine de liaison aux PKA avec, en revanche, un domaine d’adressage différent suivant les sous unités de PKA liées (Taskén and Aandahl 2004). En plus de ce domaine, les AKAPs ont aussi la capacité de s’associer à d’autres protéines comme les phosphodiesterases. Ces enzymes formeraient une barrière fonctionnelle à l’origine d’une hydrolyse de l’AMPc à la marge des microdomaines, l’empêchant de diffuser dans le cytosol (Fischmeister et al. 2006). Nous nous sommes donc intéressés à la moesin, AKAP présente dans les plaquettes ainsi qu’à la PKA-RI et la PDE2A.

L’analyse des westerns blots montre la présence (non exclusive) de la moesin et de PKA-RI au sein des microdomaines (fraction de plus faible densité) dans les plaquettes au repos. La co-localisation de ces deux protéines est confirmée par la technique d'imagerie Duolink®. Grâce à cette technique nous avons aussi mis en évidence une co-localisation de l'ACV/VI et PKA-RI mais aussi de la moesin avec la PDE2. Ces résultats sont en accord avec ceux de l’équipe de Raslan et al. montrant une localisation partielle de la sous unité PKA-RI au sein des microdomaines contrairement à la sous-unité PKA-RII (Raslan et al. 2015).

Nous émettons donc l’hypothèse qu'il existe un rapprochement de la moesin, l'ACV/VI, la PKA-RI et la PDE2 au sein de la membrane plaquettaire. Afin de confirmer la co- localisation des protéines d’intérêts avec la protéine AKAP, moesin, non seulement cette expérience devra être renouvelée mais l’utilisation d’un peptide perturbant l’interaction de la moesin avec ses protéines cibles est également envisagée. Cependant, si ces résultats sont en faveur d’une association deux par deux de ces protéines, il faut aussi démontrer qu’elles sont toutes colocalisées dans les mêmes complexes membranaires. Pour le vérifier, il faudra

Par ailleurs, la moesin et la PKA-RI ne se retrouvant pas exclusivement dans les microdomaines, nous ne pouvons affirmer que les co-localisations mises en évidence à l’aide de la technique Duolink concernent uniquement les microdomaines. Afin de confirmer la localisation de ce (ou ces) complexe(s) moléculaire(s) dans les Rafts, nous chercherons à mettre en évidence une co-localisation de ces acteurs de la voie de l’AMPc avec la protéine LAT. En effet, cette protéine retrouvée majoritairement dans les microdomaines devrait permettre de confirmer in situ la localisation. Enfin, afin de comparer la composition des microdomaines suivant les conditions de stimulation de la cellule, nous avons recherché dans les fractions isolées par gradient (fractions contenant la protéine LAT), ces acteurs de la voie de l’AMPc dont la moesin et la PKA, dans les plaquettes activées ou en présence de MβCD. Lorsque les plaquettes sont activées ou lors de la destruction des microdomaines, nous observons une redistribution de la localisation des protéines. Par la suite il nous faudra rechercher d’autres acteurs de la voie de l’AMPc comme l’adénylate V/VI et la PDE2A dans les fractions correspondant aux microdomaines, en présence et en absence de MCD mais également d’un peptide empêchant la liaison au AKAP.

Lors de cette étude, nous nous sommes également particulièrement intéressés au transporteur MRP4, qui intervient dans la régulation du taux cytosolique de l’AMPc et donc dans la fonction plaquettaire. Notre équipe a récemment publié le rôle de MRP4 dans l’homéostasie de l’AMPc plaquettaire. Ces travaux ont permis de démontrer que MRP4 représente un nouveau mécanisme de régulation de l’activation plaquettaire en transportant l’AMPc hors du cytosol vers les granules denses ou le milieu extracellulaire (Decouture et al. 2015).

Dans les plaquettes au repos, il est généralement admis que MRP4 se situe au niveau de la membrane des granules denses. Lors de l’activation plaquettaire, les granules denses fusionnent avec la membrane plasmique et toutes protéines localisées dans la membrane de ces granules se retrouvent donc relocalisées au niveau de celle-ci. De plus, toutes molécules stockées dans ces granules sont sécrétées dans le milieu extérieur comme nous avons pu le démontrer pour l’AMPc (figure 25).

Figure 25. Localisation de MRP4 après activation plaquettaire.

En revanche, en absence d’activation plaquettaire, nous n’avions pas retrouvé de sécrétion extracellulaire d’AMPc, suggérant l’absence de MRP4 à la membrane plaquettaire au repos. Cependant, la localisation de MRP4 dans les plaquettes au repos a été remise en question par l’équipe de Cheepala qui le retrouve principalement au niveau de la membrane plasmique (Cheepala et al. 2015).

S’il s’avérait que MRP4 soit aussi présent au niveau de la membrane plasmique, nos résultats pourraient alors s’expliquer par une différence de localisation de la protéine MRP4 et de l’AMPc : MRP4 se trouverait en dehors des microdomaines à distance de l’AMPc qu’il ne pourrait donc pas transporter (figure 26). L’activation plaquettaire modifiant l’organisation des microdomaines entrainerait un rapprochement de l’AMPc et de MRP4 qui l’effluerait.

Figure 26. Hypothèse de la localisation de MRP4 dans les plaquettes au repos.

Les résultats obtenus pendant cette étude montrent que MRP4 est majoritairement en dehors des microdomaines de plaquettes au repos et que l’activation plaquettaire entraine un enrichissement de MRP4 dans les microdomaines. De plus, nous n’avons pas observé de co-localisation de la moesin avec MRP4.

Ces nouvelles données sont compatibles avec nos précédents résultats de dosage d’AMPc en faveur d’une sécrétion d’AMPc qui n’aurait lieu que lors de l’activation plaquettaire. Cependant les deux hypothèses concernant la localisation de MRP4 restent envisageables à savoir que l’AMPc secrété provient de la sécrétion granulaire (MRP4 à la membrane granulaire) et/ou que l’AMPc « libéré » des microdomaines lors de l’activation plaquettaire pourrait être efflué par MRP4 localisé (ou relocalisé suite à la fusion granulaire) dans la membrane plasmique.

Pour confirmer la localisation de MRP4 dans les plaquettes au repos, nous proposons de faire un dosage extracellulaire d’AMPc en présence de MCD et de forskoline (figure 27). En effet, si le transporteur MRP4 est localisé à la membrane plasmique des plaquettes au repos, mais hors des microdomaines, l’incubation avec le MCD permettra de dénaturer ces microdomaines et ainsi permettre à l’AMPc de diffuser dans le cytosol et d’être transporter par MRP4 vers le domaine extra cellulaire.

Figure 27. Hypothèse de la voie de signalisation de l’AMPc après désorganisation des microdomaines par du MCD dans les plaquettes au repos.

En conclusion, par cette étude, nous avons mis en évidence un rôle important des microdomaines dans l’activation plaquettaire notamment par la régulation du taux d’AMPc disponible, dues à la localisation spécifique de certains acteurs indispensables à la voie de l’AMPc. Les microdomaines plaquettaires permettraient de maintenir l’AMPc très localement et de contrôler sa diffusion grâce à l’enrichissement local en PDE. En revanche, les microdomaines ne pourraient pas contenir de forts taux d’AMPc et ce dernier diffuserait dans le cytosol où il serait en partie régulé par la protéine MRP4 qui l’effluerait du cytosol vers les granules ou le milieu extérieur. En revanche, en absence de néosynthèse d’AMPc, celui-ci pourrait être libéré des microdomaines suite à leur destruction ou libéré des granules denses par exocytose lors de l’activation plaquettaire. Cependant, des études complémentaires seront nécessaires pour augmenter le nombre de données et confirmer la caractérisation de ces microdomaines.

Ces travaux ont permis d’approfondir les connaissances actuelles sur la régulation de l’AMPc plaquettaire et plus particulièrement sur sa régulation spatiale par la protéine MRP4 et les microdomaines.

Etant la principale voie participant au maintien des plaquettes au repos dans la circulation, l’étude de la voie de signalisation de l’AMPc est d’autant plus importante qu’elle est la principale cible des antiplaquettaires.

En effet, la plupart des antiplaquettaires interviennent en modulant les concentrations en nucléotides cycliques et plus particulièrement en modulant le taux d’AMPc.

On retrouve parmi eux, les inhibiteurs directs et les métabolites actifs des inhibiteurs indirects de la voie de l’ADP qui, en se fixant sur les récepteurs P2Y12 des plaquettes sanguines, empêchent la liaison du ligand naturel : l’ADP. L’AC n’étant plus inhibée, synthétise de l’AMPc qui va pouvoir agir sur ses effecteurs secondaires et entrainer l’inhibition de l’agrégation plaquettaire (cf. chapitre)

On retrouve également des inhibiteurs de phosphodiestérases. De nos jours, plusieurs inhibiteurs non sélectifs ou sélectifs des isoformes de la PDE ont été développés, cependant, un seul d’entre eux est entré en utilisation clinique en tant qu’agent antiplaquettaire : le dipyridamole.

Le dipyridamole, molécule inhibitrice des PDE3 et 5, va en les inhibant, augmenter le taux d’AMPc et de GMPc intraplaquettaire et ainsi permettre l’inhibition de l’agrégation.

L’action anti-plaquettaire de cette molécule et également due à l’inhibition de la recapture de l’adénosine qui en stimulant AC, serait à l’origine de la production d’AMPc (Gresele, Momi, and Falcinelli 2011).

Enfin, Il a également été proposé d’utiliser un antiagrégant plaquettaire endogène comme antiplaquettaire : la PGI2.

Cependant, ayant une demi-vie très courte (2 à 3 min), la PGI2 n’est pas utilisée comme médicament. C’est pourquoi, un analogue à demi-vie plus longue (20 à 30 min) a été créé : l’iloprost. Ce médicament ayant les mêmes propriétés pharmacologiques que la PGI2 permet l’inhibition de l’activation plaquettaire (cf. chapitre introduction II/2).

Figure 28. Représentation des différents antiplaquettaires et leurs cibles plaquettaires

Malgré la présence sur le marché de nombreux antiplaquettaires, ceux présentés ci-dessus mais également les inhibiteurs de la cyclo-oxygénase 1 (COX) dont le chef de file est l’aspirine qui inhibent la voie du TXA2 ainsi que les antagonistes du récepteur GPIIbIIIa (IIb3)(figure 28), les thromboses artérielles, découlant d’une activation excessive des plaquettes, ainsi que ses complications (accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, coronaropathies et artériopathies des membres inférieurs) restent une des principales causes de mortalité dans les pays développés et constitue donc un problème de santé publique majeur.

C’est pourquoi l’amélioration des connaissances de cette voie majeure de signalisation plaquettaire devrait conduire à mieux comprendre les mécanismes des antiplaquettaires actuels et à définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour des futurs antiplaquettaires. Notre équipe participe ainsi au développement d’un inhibiteur de MRP4. Toutefois d’autre cibles pourraient être intéressantes comme les AKAPs. En effet, l'identification de petites molécules perturbant l'interaction des AKAPs avec un partenaire moléculaire particulier comme la PKA pourrait servir de base à un nouveau concept dans le traitement des thromboses.

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