II. Caractérisation des microdomaines
1. Isolement des microdomaines : mise au point et validation de la technique
Les microdomaines, de par leurs compositions, sont insolubles dans les détergents doux et ont une faible densité. Grâce à ces caractéristiques spécifiques et à l’aide de la littérature, nous avons mis au point, au sein de notre unité, la technique d’isolement des microdomaines. Chaque étape de la technique est critique que ce soit la lyse des échantillons, la préparation des gradients, le choix de la centrifugation ou la précipitation des protéines, ainsi de nombreux paramètres ont dû être validés au cours des différentes
% inhibition MBCD et Fk 0.25 µM
0 25 50 75 100 absence de forskoline forskoline 0,25 µM 0 0.25 0.5 1.25 2.5 5 * * * [MBCD] en mM %i n h ib it io n à 2 0 0 s e c % inhibition MBCD et Fk 0.25 µM 0 25 50 75 100 absence de forskoline forskoline 0,25 µM 0 0.25 0.5 1.25 2.5 5 * * * [MBCD] en mM %i n h ib it io n à 2 0 0 s e cLes premiers essais d’isolement des microdomaines utilisant une ultracentrifugeuse avec un rotor à angle fixe n’ont pas été satisfaisants en termes de reproductibilité. C'est pourquoi nous avons validé par la suite l’utilisation d’un rotor à godets oscillants permettant une meilleure distribution des échantillons pendant la centrifugation et ainsi une meilleure répétabilité et reproductibilité. La température est aussi un paramètre très important, les échantillons doivent être le plus possible manipulés à 4°C. C’est pourquoi la récupération des fractions est réalisée en chambre froide. Dans le but d’améliorer encore la reproductibilité, un dispositif automatique avec une pompe a été aussi testé, pour récupérer les échantillons après l'ultracentrifugation. Ce système consiste à percer le tube par le bas grâce à une aiguille et à y injecter du fluorinerte qui pousse le gradient vers le haut du tube. Les différentes fractions sont collectées à la sortie de la tubulure dans une plaque à 96 puits. Au final ce système n’a pas amélioré la reproductibilité et l’utilisation de celui-ci rallongeait le temps de l’expérience, nous avons donc fait le choix de récupérer les différentes fractions manuellement par pipetage successif à la surface du gradient.
Après précipitation par le TCA des protéines présentes dans les fractions récupérées, puis réduction et dénaturation des échantillons, un Western Blot est réalisé pour visualiser les protéines contenues ou non dans les microdomaines. Cette étape permet d'identifier les fractions qui correspondent aux microdomaines. Dans la littérature différentes protéines sont utilisées comme marqueur positif et négatif des microdomaines. Nous avons testé les protéines : LAT et CD36 (protéines transmembranaires) décrites comme enrichies dans les microdomaines. Comme marqueur d’exclusion, la protéine tyrosine kinase (Syk) et la sous- unité β3, de l’intégrine αIIbβ3, ont été utilisées. Par la suite, nous avons choisi d’utiliser comme marqueur positif la protéine LAT qui présente le meilleur enrichissement dans les microdomaines, et comme marqueur d’exclusion, la protéine tyrosine kinase Syk (figure 17). En effet, l’anticorps anti-β3 étant polyclonal, les Western blots présentaient divers marquages non spécifiques.
Une étape importante de la mise au point a également été de définir la concentration optimale du détergent nécessaire pour permettre la lyse des cellules tout en conservant les microdomaines (Rabani et al. 2016). Différentes concentrations de Triton X-100 dans le tampon de lyse ont été étudiées (de 0,1% à 1%). Cette concentration devait être assez élevée pour séparer les microdomaines des autres parties cellulaires mais pas trop pour ne
pas les solubiliser et les détruire. Une concentration finale de 0,5% de Triton X-100 a été choisie, celle-ci permettant le meilleur isolement des fractions contenant les microdomaines plaquettaires ainsi que le meilleur enrichissement des protéines décrites comme marqueur de microdomaine (figure 16).
Figure 16. Isolement des microdomaines dans le gradient de sucrose après ultracentrifugation.
Lors de la récupération des tubes après 18 heures d’ultracentrifugation à rotor, on visualise les microdomaines « flottant » dans le gradient de sucrose, sous un aspect floconeux.
Ces mises au point nous ont permis de définir un protocole final (présenté dans la section « matériels et méthodes ») dont les premiers résultats obtenus lors d’une expérience réalisée en duplicate sont présentés ci-dessous. Toutefois, des résultats similaires ont parfois été obtenus également lors des mises au point. Nous avons ainsi pu observer que les microdomaines de plaquettes au repos sont présents dans les fractions de densité plus faible (fraction 5 et 6) comme en témoigne la présence de LAT (> 98%) et l’absence de Syk (< 1%) (figure 17).
Figure 17. Isolement des microdomaines (Raft) des plaquettes au repos.
Les plaquettes lavées au repos (6.10^8 plaquettes) sont lysées par 0,5% de Triton-100X puis séparées en différentes fractions (microdomaines et non microdomaines) dans un gradient de sucrose par ultracentrifugation.
Les microdomaines sont ensuite mis en évidence par la présence de LAT (poids moléculaire PM = 36) et l'absence de Syk (PM = 72). Western blots d’une expérience réalisée en duplicate.
Par la suite, nous avons isolé les microdomaines de plaquettes activées (figure 18). Ces dernières présentent un profil différent pour les microdomaines. En effet, dans cette expérience préliminaire, LAT réapparait dans les fractions 9 à 13 (fractions de faible flottaison) qui ne correspondent pas aux microdomaines, et son enrichissement dans les microdomaines n’est plus que de 12% tandis qu’au repos, elle y est présente à plus de 98%. Quant à Syk, lorsque les plaquettes sont activées, on la retrouve également dans les fractions 10 et 11, tandis qu’au repos elle n’est présente que dans les fractions 12-13. L’activation plaquettaire entraine un changement conformationnel de la membrane plasmique d’une part, par la fusion des membranes granulaires exocytés puis, par la formation de pseudopodes. Ce changement pourrait expliquer la désorganisation et/ou un réarrangement des microdomaines.
Figure 18. Isolement des microdomaines d'une suspension de plaquettes activées.
Les suspensions de plaquettes lavées, activées au PAR1-ap (20 µM), sont lysées par un tampon de lyse (2X) contenant 1% de Triton-100X puis séparées en différentes fractions (microdomaines et non microdomaines) dans un gradient de sucrose par ultracentrifugation. Les microdomaines sont ensuite mis en évidence par la présence de LAT et l'absence de Syk. Western blots d’une expérience réalisée en duplicate.
Nous avons également voulu étudier la position des protéines présentes dans les microdomaines lorsque l’on incube les plaquettes avec un désorganisateur des microdomaines, le MCD.
Ces expériences montrent un profil similaire aux plaquettes activées pour la protéine LAT. En effet, tout comme dans les plaquettes activées, on retrouve LAT dans les fractions de fortes densités mais également dans les microdomaines. Toutefois ici, on ne les retrouve pas aux mêmes pourcentages (46% dans les fractions de forte densité, et 41% dans les microdomaines). De plus, on retrouve un continuum entre les rafts et les non rafts (fraction 8 et 9).
L’incubation des plaquettes avec 5 mM de MCD entraine en effet une désorganisation des microdomaines membranaires, cependant la présence de LAT dans les fractions correspondant aux microdomaines suggère une déplétion partielle en cholestérol des membranes plaquettaires et donc la persistance de certains microdomaines. L'expérience devra être renouvelé en présence d'une concentration plus forte de MCD.
Figure 19. Isolement des microdomaines (Raft) des plaquettes au repos préalablement incubées au MCD (5 mM).
Préalablement incubées avec du MCD (5 mM), Les plaquettes lavées au repos (6.108 plaquettes) sont lysées par 0,5% de Triton-100X puis séparées dans un gradient de sucrose par ultracentrifugation. La protéine LAT est alors mis en évidence dans les différentes fractions par western blot.