Mise au point du criblage : Choix du milieu

Le choix du milieu pour le criblage est primordial, il doit permettre une biodisponibilité du cholestérol suffisante pour la production de coprostanol et celle-ci doit être détectable en GC/MS. La stratégie adoptée est double : tout d’abord tester des milieux standards pour la croissance de E. coli (Luria-Bertani et TB, tableau 9), organisme hôte des banques génomiques. Mais aussi tester le milieu utilisé pour l’isolement des bactéries commensales (LYHBHI) qui semble adapté à la production de coprostanol.

4.3.1.1 Détection du cholestérol dans les milieux frais

Notre but était de trouver un moyen simple et rapide de doser le cholestérol dans nos milieux pour deux raisons 1) connaître la quantité exacte de cholestérol disponible pour la réaction de conversion en coprostanol et potentiellement pouvoir calculer des rendements de production et 2) mettre en évidence une relation de corrélation entre consommation de cholestérol et production de coprostanol pour pouvoir remplacer la méthode de GC/MS qui est coûteuse et demande beaucoup de temps.

4.3.1.1.1 Milieux testés

Nous avons testé plusieurs protocoles d’ajout de cholestérol dans le milieu LB (Luria- Bertani) pour la croissance de la souche E. coli

Tableau 9 : Composition et protocole de réalisation des milieux supplémentés en cholestérol

Noms Ajout à 1 L de LB Protocole

LB.1 Cholestérol 0,2 g/L, phosphatidylcholine 1 g/L

Les composants sont ajoutés dans 50 mL d’eau stérile et mis sous agitation pendant une nuit à 30 °C. Ce mélange est ensuite ajouté à la fraction principale de milieu LB avant de subir deux cycles d’autoclavage à 120 °C pendant 20 min. LB.2 Cholestérol 0,2 g/L, α-

cyclodextrine 0,1 g/L

Le cholestérol est dissous dans 50 mL d’eau stérile sous agitation pendant une nuit à 30 °C. La cyclodextrine est ajoutée le lendemain et le mélange est additionné au milieu LB avant de subir deux cycles d’autoclavage à 120 °C pendant 20 min.

LB.3 Sérum de Veau 10 % 100 mL de sérum bovin (environ 0,31 g/L de cholestérol) est ajouté à 900 mL de LB et filtrer la préparation.

LB.4 Cholestérol 0,2 g/L, phosphatidylcholine 1 g/L sous forme de liposomes

Les composants sont dissous selon le même protocole que pour le milieu LB.1 mais dans 50 mL de LB et non dans l’eau distillée. Après les cycles d’autoclavage, la solution subit 10 cycles de congélation/décongélation : 10 min dans l’azote liquide/10 min dans un bain-marie à 65 °C et vortex entre chaque cycle. Ajouter à la fraction principale de milieu LB.

4.3.1.1.2 Tests réalisés

Nous avons utilisé le kit Amplex®_{Red fourni par Invitrogen. Ce kit peut détecter des} concentrations en cholestérol allant de 80 ng/mL jusqu’à 2 mg/mL. Le principe est basé sur la détection de peroxyde d’hydrogène (H2O2) libéré lors de la conversion du cholestérol en cholesténone. Cette molécule va ensuite réagir avec un fluorophore, le 10-acetyl-3,7- dihydroxyphenoxazine pour donner la résorufine qui possède une longueur d’onde d’excitation à 571 nm et une longueur d’onde d’émission à 585 nm (figure 21).

Figure 21 : Principe de détection du cholestérol par le kit Amplex®Red

Les enzymes indiquées en rouge ainsi que le réactif 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine sont fournis par le kit. La réaction est stoechiométrique ce qui permet de calculer la concentration en cholestérol à partir de la quantité de résorufine.

Le protocole est réalisé selon les recommandations du fournisseur. Dans un premier temps, des gammes étalons sont préparées par dilutions successives pour le cholestérol (entre 0 et 20 µM), le peroxyde d’hydrogène (entre 0 et 20 µM) et la résorufine (entre 0 et 20 µM). Les échantillons sont dilués 150X dans du tampon de réaction (1X) pour atteindre une concentration entrant dans la courbe étalon (environ 200 µg/mL dans les milieux). 50 µL des échantillons et des standards pour le cholestérol et le peroxyde d’hydrogène sont disposés dans des puits séparés sur une microplaque. 50 µL de la solution de réaction du kit sont ajoutés à chaque puits en semi-obscurité (le réactif est sensible à la lumière). Cette solution contient 300 µM de réactif Amplex®_{Red, 2 U/mL de péroxydase de raifort, 2 U/mL d’oxydase de cholestérol et 0,2 U/mL} d’estérase de cholestérol. La plaque est incubée à 37 °C durant 45 min. Pour la résorufine, 100 µL de chaque dilution sont directement déposés dans des puits vides. La fluorescence est mesurée avec le Synergy 2 BioTek® _{aux longueurs d’ondes correspondantes à la résorufine} (excitation 571 nm et émission à 585 nm). Pour chaque point, l’appareil corrige la valeur par le bruit de fond obtenu dans le puits avec tous les réactifs mais sans cholestérol.

4.3.1.2 Choix d’un témoin pour la biodisponibilité du cholestérol

Après ces expériences, la biodisponibilité du cholestérol est apparue comme un facteur déterminant de l’étude. Un témoin positif pour ce critère a donc été recherché. Nous avons sélectionné dans la littérature une souche de E. coli BL21 portant un plasmide pET24b(+) codant pour une cholestérol oxydase (COX). Cette enzyme issue de la souche Brevibacterium sterolicum, est connue pour transformer le cholestérol en cholesténone (figures 13 et 21). La souche de E.

coli contenant le plasmide a été fournie par l'équipe italienne (Département des sciences

moléculaires et des biotechnologies, Université de l’Insubrie, Varèse, Italie) qui a cloné le gène (Volontè et al. 2010). La particularité de cette souche est d’avoir une production d’enzyme optimale dans le milieu dit « TB », un milieu LB légèrement modifié dont la composition se trouve dans la première ligne du tableau 10. Après réception de la souche sous forme de boîte de pétri LB + kanamycine (30 µg/mL), une dizaine de colonies sont repiquées en milieu liquide TB + kanamycine (30 µg/mL). Trois sont choisies au hasard pour subir une extraction de plasmide et un séquençage (eurofins Genomics) afin de vérifier la séquence du gène. Puis ces cultures sont mises en collection et conservées à -80 °C pour des utilisations ultérieures.

4.3.1.3 Suivi de croissance des souches de E. coli

Sur la base de nos résultats et pour des considérations techniques, la méthode retenue pour l’apport du cholestérol dans le milieu est une version modifiée de celle expliquée en première ligne du tableau 9. L’eau stérile est en effet remplacée par le milieu souhaité (TB ou LYHBHI, tableau 10) stérile.

Avant de commencer le criblage, nous avons voulu vérifier quelques hypothèses : 1) Une pré-culture n’est pas nécessaire à l’obtention d’une biomasse suffisante ; 2) La présence d’un fosmide n’influence pas la croissance de ces souches ; 3) La présence du mélange CH/PC et 4) Le mode de stérilisation du milieu influence(nt) potentiellement la croissance de ces bactéries.

4.3.1.3.1 Suivi de l’absorbance à 600 nm sur la souche E. coli EPI300

Ici nous voulons voir si une pré-culture influence ou non la production de biomasse. Des souches de E. coli EPI300 sans fosmide sont striées sur LB puis inoculées dans 5 mL des six milieux présentés dans le tableau 10. L’aborbance est ensuite mesurée toutes les heures pendant 20 h. Pour les mesures avec pré-culture, le protocole est le même sauf que les milieux sont inoculés à partir de cultures liquides fraîches de 15-16 h (une nuit à 37 °C sous agitation). L’absorbance à 600 nm initiale est d’environ 0,1. Les cultures sont faites en triplicats pour chaque milieu.

Tableau 10 : Milieux utilisés pour le suivi de croissance et les tests préliminaires en GC/MS

4.3.1.3.2 Suivi de l’absorbance à 600nm couplée au dénombrement sur boîte Ici nous voulons voir si la présence d’un fosmide a un impact sur la croissance de la souche. Nous voulons également vérifier si la présence du mélange CH/PC et/ou le mode de stérilisation des milieux influencent la croissance des souches.

Des souches de E. coli EPI300 avec ou sans fosmide sont inoculées sans pré-culture dans

Nom Composition pour 1 L Type de stérilisation

TB Tryptone 12 g, extrait de levure 24 g, glycérol (100 %) 8 mL, KH2PO4 16 mM et K2HPO4 51 mM

Filtration sur filtre 0,22 µm

TB CH/PC Idem TB + Cholestérol 0,2 g et

phosphatidylcholine 1 g

TB filtré sur filtre 0,22 µm Solution mère CH/PC 2 fois à 120°C pendant 20min

Rassemblement de ces deux fractions

TB CH/PC* Idem TB CH/PC Mélange TB filtré + solution

CH/PC et stérilisation 2 fois 120°C pendant 20 min

LYHBHI Cf ligne 1 tableau 5 Stérilisation standard 120°C, 20

min LYHBHI CH/PC Idem LYHBHI + Cholestérol 0,2 g et

phosphatidylcholine 1 g

Idem TB CH/PC

chloramphénicol à 12,5 µg/mL pour la souche avec fosmide. En effet, celui-ci porte un gène de résistance à l’antibiotique permettant la survie de la souche transformée contrairement à la souche non transformée. Un suivi de croissance est effectué toutes les heures pendant 20 h par une mesure de l’absorbance à 600 nm couplée à un dénombrement sur boîtes de TB ou de LYHBHI des dilutions 10-1 _{à 10}-5 _{pour les cinq premières heures puis 10}-5 _{à 10}-7 _{pour les temps} de 6 et 7 h et jusqu’à 10-9 _{pour le reste (jusqu’à 20 h).}

4.3.1.4 Tests préliminaires en GC/MS

Les hypothèses de travail sont les suivantes : 1) Les souches de E. coli utilisées pour la construction des banques ne produisent pas de coprostanol ; 2) Ces souches n’ont pas d’effet connu sur le composé coprostanol (dégradation, transformation, etc.) ; 3) Le cholestérol est biodisponible dans les milieux testés (lequel donne la meilleure biodisponibilité) et 4) La méthode de GC/MS permet bien de détecter le coprostanol.

4.3.1.4.1 Production de coprostanol et détection du cholestérol

Les deux souches, E. coli EPI300 avec ou sans fosmide, sont cultivées à partir de stries fraîches, dans les différents milieux testés (tableau 10), une nuit (environ 16 h) à 37 °C avec antibiotique (chloramphénicol 12,5 µg/mL) pour la souche avec fosmide. Puis une extraction de stérols (paragraphe 4.1.3.1 de ce chapitre) et une mesure du cholestérol et du coprostanol (paragraphe 4.1.3.2 de ce chapitre) sont effectuées.

4.3.1.4.2 Transformation du coprostanol

10 mg de coprostanol et 50 mg de phosphatidylcholine sont dissous dans 1 mL de TB filtré et mis sous agitation toute la nuit à 30 °C. La souche E. coli EPI300 contenant un fosmide vide est cultivée dans les six milieux testés (tableau 10), une nuit (soit environ 16 h) à 37 °C avec antibiotique (chloramphénicol 12,5 µg/mL) et en présence de coprostanol (concentration finale dans le milieu 50 µg/mL). Les échantillons subissent ensuite une extraction de stérols (paragraphe 4.1.3.1 de ce chapitre) puis une analyse de la composition en cholestérol et coprostanol par GC/MC (paragraphe 4.1.3.2 de ce chapitre).

4.3.1.4.3 Biodisponibilité du cholestérol

La souche de E. coli BL21 présentée dans le paragraphe 3.3.1.2 et contenant un plasmide codant pour une cholestérol oxydase est striée en milieu LB additionné de kanamycine (30 µg/mL). Après une nuit à 37 °C, les six milieux à tester (tableau 10) supplémentés en kanamycine (30 µg/mL) sont inoculés, six répétitions par milieu sont réalisées. Après 3 h à 37 °C, les cultures atteignent une absorbance à 600 nm comprise entre 1,5 et 2. A ce moment là, la moitié d’entre elles sont induites avec de l’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 0,25 mM en accord avec le protocole de Volonté et al. (2010). Les échantillons subissent ensuite une

extraction de stérols (paragraphe 3.1.3.1 de ce chapitre) puis une analyse de la composition en cholestérol et coprostanol par GC/MC (paragraphe 4.1.3.2 de ce chapitre).

4.3.2 Criblage des banques génomiques