4. Matériels et méthodes
4.2 Les banques génomiques
4.2.1 Construction des banques génomiques 4.2.1.1 Définition d’une banque génomique
Une banque génomique est un ensemble de clones contenant des fragments d’ADN (appelés « inserts ») représentatifs d’un génome. Ces clones sont eux-mêmes contenus dans des hôtes (le plus souvent bactéries et surtout E. coli mais les levures peuvent également être utilisées). Une banque génomique se caractérise par la taille de l’insert, le type de vecteur utilisé et le nombre de clones qui la constitue. Elle permet d’avoir une copie « complète » du génome d’un organisme. Les banques génomiques offrent l’opportunité de cribler des fragments d’ADN dans le but de trouver des gènes impliqués dans un phénotype particulier. Elles mettent à disposition des séquences d’ADN pour de futures utilisations, dans d’autres objectifs.
4.2.1.2 Principe de la construction d’une banque génomique
La construction d’une banque génomique repose sur le cassage de l’ADN génomique en fragments. Ceux-ci sont ensuite ligués dans un vecteur. Le produit de cette ligation est transformé dans un hôte permettant ainsi d’obtenir des clones génomiques. Il existe plusieurs types de vecteurs qui se différencient par leur capacité à héberger de l’ADN « étranger » (tableau 8). Le choix du vecteur prend en compte la taille du génome étudié et la question scientifique associée qui déterminent en général la taille des fragments. Ces deux données (taille du génome et taille des fragments) servent à déterminer le nombre de clones nécessaire à un bon recouvrement du génome. C'est-à-dire le nombre de clones suffisant pour avoir au moins une fois toutes les séquences d’ADN du génome cible. Un autre critère de choix du vecteur peut aussi être la facilité d’emploi de ce vecteur couplée à l’hôte utilisé. Les chromosomes artificiels de levures (YAC) par exemple sont des vecteurs réservés aux levures.
Tableau 8 : Taille possible de l’insert en fonction du type de vecteur
Vecteur Taille maximale de l’insert (kb)
Plasmides 20
Phages λ 25
Fosmides 40
Cosmides 45
Phages P1 100
BAC (chromosome bactérien artificiel) 300
YAC (chromosome artificiel de levure) 200-2000
4.2.1.3 Construction de la banque de Bacteroides sp. D8
La banque génomique de Bacteroides sp. D8 a été construite par le prestataire privé Libragen® dans la bactérie E. coli EPI100 et en utilisant des fosmides comme vecteurs pour l’ADN génomique. En effet, ils sont plus stables que les cosmides pour une taille d’insert similaire (environ 40 kb). Les fosmides ont moins de copies par bactérie favorisant la possibilité de copier des segments génomiques instables ou non clonables (éléments répétés, bases modifiées, etc.) dans d’autres vecteurs. Ceci augmente également la probabilité d’avoir une représentation complète du génome (Kim et al. 1992). La banque génomique de Bacteroides sp. D8 contient 768 clones
4.2.1.4 Construction de la banque de Bacteroides sp. BV
La bactérie Bacteroides sp. BV a été identifiée à partir de la campagne d’isolement décrite en paragraphe 3.1.1 comme souche productrice de coprostanol.
La banque génomique de Bacteroides sp. BV contient 2024 clones. J’ai participé à la construction de cette banque réalisée principalement par Aicha Kriaa, étudiante en Master 2 puis en thèse dans l’équipe Ife en 2014. Pour ce faire, le protocole du kit fourni par Epicentre, CopyControl™ HTP Fosmid Library Production Kit with pCC2FOS™ Vector, a été suivi. Les étapes sont résumées sur la figure 20.
Figure 20 : Etapes de la construction de banques génomiques fosmidiques d’après le protocole epicentre
CopyControlTM HTP Fosmid Library Production Kit with pCC2FOSTM Vector.
1 : Extraction d’ADN génomique, 2 : Fragmentation mécanique de l’ADN, 3 : Sélection de la taille des fragments (environ 40kb), 4 : Ligation dans les fosmides, 5 : Empaquetage dans les phages λ et transformation chez E. coliEPI300, 6 : Etalement sur milieu sélectif LB + chloramphénicol 12,5 µg/mL et 7 : Repiquage des colonies dans milieu neuf sur plaque 96 puits pour conservation à -80°C
La particularité de cette banque est que le nombre de copies du fosmide par bactérie est inductible.
4.2.2 Vérification de la robustesse des banques génomiques
La qualité d’une banque génomique se mesure par sa redondance (les fragments d’ADN contenus dans les inserts doivent être différents les uns des autres) et le recouvrement (la capacité de la banque à représenter le génome entier de l’organisme cible). Celui-ci se calcule de la manière suivante :
𝑎 = 𝑁.𝐿 𝐺
Où N est le nombre de clones de la banque génomique, L la taille de l’insert et G la taille du génome de l’organisme cible. La probabilité P d’avoir un recouvrement satisfaisant (P=0.99) suit une loi de Poisson :
𝑃 = 1 − 𝑒−𝑎⇔ 𝑁 = −G. ln (1 − P)
L
Une probabilité P de 99 % signifie qu’il y a 99 % de chance que la banque contienne suffisamment de clones pour avoir toutes les séquences d’ADN de l’organisme cible dans la banque génomique.
4.2.2.1 Rapport d’analyse de la banque génomique de Bacteroides sp. D8
La société Libragen® nous a fourni un rapport qualité sur la banque de Bacteroides sp. D8 dont le génome fait environ 6 Mb. Celui-ci garanti la taille de 40 kb des inserts et la non redondance de la banque.
4.2.2.2 Analyse de la qualité des banques génomiques
La qualité des banques de Bacteroides sp. D8 et Bacteoides sp. BV (génomes de 6 Mb environ) a été vérifiée sur 5 clones pris au hasard pour la D8 (conformément au rapport fourni par Libragen®) soit 0,65 % de la banque et 20 clones également pris au hasard pour la BV soit 0,99 % de la banque. La première étape est l’extraction de fosmides sur des cultures fraîches de bactéries. Cette étape est faite à partir de 10 mL de LB, chloramphénicol 12,5 µg/mL additionné de 20 µL de solution d'induction (seulement pour la banque BV dont le nombre de copies du fosmide est inductible) en suivant le protocole du kit FosmidMAX™ DNA Purification fourni par Epicentre. Le principe du kit repose sur la lyse chimique (alcaline) des bactéries, puis la précipitation des acides nucléiques grâce à l’isopropanol. L’ARN est ensuite digéré grâce à une RNase en solution dans un mélange fourni par le kit. Enfin, les impuretés sont éliminées et les fosmides sont précipités à l’aide d’éthanol. La seconde étape est la vérification de la quantité et de la qualité des fosmides par analyse au NanoDrop (ThermoFischer) et par migration sur gel d’agarose à 0,8%. Les fosmides sont ensuite digérés par l’enzyme de restriction HindIII (1 site de restriction dans le fosmide pCC2FOSTM).