Mise en œuvre

Há inúmeros estudos sobre a produção de metabolitos secundários e cultura in vitro de plantas e imensas revisões que compilam muita dessa informação (Zhang & Furusaki, 1999; Chattopadhyay et al., 2002; Karuppusamy, 2009; Matkowski, 2008). No entanto, a grande maioria da informação necessita de ser atualizada e focalizada somente na produção de compostos fenólicos. Na Tabela 2, estão descritos os compostos fenólicos (extratos fenólicos e individuais, incluindo antocianinas) produzidos em cultura de células vegetais, descrevendo a origem dos mesmos e o processo de extração dos compostos. A produção de extratos fenólicos é o objetivo da grande maioria dos estudos revistos (Andarwulan & Shetty, 1999; Lozovaya et al., 2000; Santos-Gomes et al., 2003; Gális et al., 2004; Lozovaya et al., 2006; Kouakou et al., 2007; Bairu et al., 2011; Cui et al., 2011;

Krzyzanowska et al., 2011; Palacio et al., 2012; Szopa et al., 2013; Siu et al., 2014; Szopa &Ekiert, 2014; Yildirim & Turker, 2014). No entanto, alguns desses trabalhos focalizam-se também no estudo de propriedades bioativas desses extratos fenólicos, nomeadamente propriedades antioxidantes (Grzegorczyk et al., 2007; Hakkim et al., 2007; Kovatcheva- Apostolova et al., 2008; Hussein et al., 2010; Amoo et al., 2012; Giri et al., 2012; Khateeb et al., 2012; Barros et al., 2013; Bhagya & Chandrashekar, 2013; Chaniany et al., 2013; Madhu, 2013; Goyali et al., 2014; Lugato et al., 2014; Piątczak et al., 2014; Valdez-Tapia et al., 2014), antimicrobianas (Hussein et al., 2010; Ncube te al., 2011; Zhao et al., 2011; Khateeb et al., 2012) e mesmo citotóxicas (Skoríc et al., 2012).

Tabela 2. Extratos fenólicos e compostos fenólicos individuais produzidos por cultura de tecidos vegetais (Dias et al., 2016)

Composto/extrato bioativo Origem Solvente de extração Referência

Antocianinas Eugenia myrtifolia Sims (rebentos) Longo et al. 2007

Extratos bioativos Satureja hortensis L. (calli) Metanol Gϋllϋce et al., 2003

Glucoiridóides Penstemon serrulatus Menz. (calli) Etanol Bazylak et al., 1996

Compostos fenólicos individuais Helichrysum aureonitens L. Moench (calli) Água:Etanol (5:95, v/v) Ziaratnia et al. 2009

Mirabilis jalapa L. (calli) Diclorometano:Metanol (50:50, v/v) Yang et al. 2001

Ocimum americanum L., var. pilosum (rebentos) Extratos alcoólicos Rady & Nazif, 2005

Psoralea corylifolia L. (calli) Ácido sulfúrico Shinde et al. 2010

Rauwolfia serpentina Benth. ex Kurz (células) Metanol Schroeder et al. 1996

Salvia miltiorrhiza Bunge (raízes tansgénicas) Metanol Chen te al., 1999

Scutellaria baicalensis Georgi (raízes tansgénicas) Metanol Nishikaw et al. 1999

Ácidos fenólicos Eryngium planum L. (raízes e rebentos) Água:Metanol (50:50, v/v) Thiem et al., 2013

Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.( calli) Metanol Szopa & Ekiert 2012

Theobroma cacao L. (estaminódios/anteras) Água:Metanol (20:80, v/v) Alemanno et al. 2003

Compostos fenólicos Aloe arborescens Mill rebentos Água:Metanol (50:50, v/v) Amoo et al., 2012

Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott (rebentos e calli) Metanol Szopa & Ekiert, 2014

Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott (rebentos e calli) Metanol Szopa et al., 2013

Brassica nigra L. (calli) Metanol Hussein et al., 2010

Castilleja tenuiflora Benth. (rebentos) Metanol Valdez-Tapia et al., 2014

Cichorium pumilum Jacq. (calli) Água:Metanol (5:95, v/v) Khateeb et al. 2012

Cistus creticus subsp.creticus L. (rebentos e raízes) Água:Etanol (3:97, v/v) Skoríc et al. 2012

Clitorea ternatea L.(rebentos) Etanol Madhu 2013

Coriandrum sativum L.( partes vegetativas) Água:Metanol (20:80, v/v) Barros et al. 2012

Daucus carota L. (raízes transgénicas) Água:Metanol (50:50, v/v) Sircar et al., 2007

Fagopyrum tataricum Gaertn. (calli) Lozovaya et al., 2000

Fragaria vesca L. (folhas e calli) Metanol Yildirim & Turker, 2014

Gossypium hirsutum L. (calli) Metanol Kouakou et al. 2007

Habenaria edgeworthii Hook. f. ex. Collett (calli) Água:Metanol (20:80, v/v) Giri et al. 2012

Hypericum perforatum L. (raízes adventícias) Água:Metanol (20:80, v/v) Cui et al., 2011

Hypericum polyanthemum (partes aéreas) Metanol Nunes et al., 2009

Hypericum rumeliacum Boiss. (rebentos) Metanol Danova et al. 2010

Hypericum ternum A. St. Hil. (partes aéreas) Metanol Pinhatti et al. 2010

Juglans regiaL. (micro-rebentos) Água:Metanol (20:80, v/v) Cheniany et al., 2013

Justicia gendarussa Burm. f. (caules, folhas e calli) Etanol, metanol e éter Bhagya & Chandrashekar, 2013

Larrea divaricata Cav. (calli) Água:Metanol (5:95, v/v) Palacio et al. 2012

Lavandula vera DC Água:Etanol (60:40, v/v) Kovatcheva-Apostolova et al. 2008

Melissa officinalis L. (partes aéreas) Água Barros et al., 2013

Mentha longifolia (L.) Huds. (calli e células) Água:Metanol (30:70, v/v) Krzyzanowska et al., 2011

Mentha piperita L. (calli e células) Água:Metanol (30:70, v/v) Krzyzanowska et al., 2011

Ocimum sanctum L. (calli) Água:Metanol (20:80, v/v) Hakkim et al., 2007

Passiflora alata Curtis (folhas) Água:Etanol misturas Lugato et al., 2014

Pimpinella anisum L. (raízes) Água:Etanol (5:95, v/v) Andarwulan & Shetty, 1999

Rehmannia glutinosa Libosch (folhas e raízes) Metanol Piątczak et al., 2014

Rosa damascena Mill. Água:Etanol (60:40, v/v) Kovatcheva-Apostolova et al. 2008

Salvia miltiorrhiza Bunge (raízes transgénicas) Água:Etanol (5:95, v/v) Zhao et al., 2011

Salvia miltiorrhiza L. (raízes transgénicas) Tampão fosfato (75mM, pH=7) Siu et al., 2014

Salvia officinalis L. (rebentos e raízes) Metanol ou acetona Grzegorczyk et al 2007

Salvia officinalis L. (calli e células) Acetona Santos-Gomes et al. 2003

Solidago graminifolia L. (plântulas e calli) Metanol Thiem et al., 2011

Solidago virgaurea L. (plântulas e calli) Metanol Thiem et al., 2011

Tulbaghia violacea Harv. (partes aéreas) Água:Metanol (50:50, v/v) Ncube et al. 2011

Vaccinium angustifolium Ait. (folhas) Água:Acetona:Ácido fórmico

(20:80:0.1 v/v/%) Goyali et al., 2014

Zea mays L. (calli) Lozovaya et al., 2000

Zea mays L. (calli) Lozovaya et al., 2006

Compostos fenólicos e antocianinas Ipomoea batatas L. cv Ayamurasaki (calli) Ácido acético 16% Konczak-Islam et al., 2003; Konczak-Islam et al., 2005

Compostos fenólicos em extrato de

betalaínas Beta vulgaris cv. Detroit Dark Red (raízes transgénicas) Água:Etanol (30:70 v/v) Georgiev et al. 2010

Compostos fenólicos, flavanois Taxus baccata L. (calli) Água:Etanol (30:70 v/v) Dubravina et al. 2005

Taxus canadensis Marsh. (calli) Água:Etanol (30:70 v/v) Dubravina et al. 2005 Compostos fenólicos, galotaninos,

iridóides

Harpagophytum procumbens (Burch.) DC. ex Meisn

(plântulas e calli) Água:Metanol (50:50, v/v) Bairu et al. 2011

Compostos fenólicos tetra-

hidroprotoberberinas C. ochotensis var. raddeana (calli) Iwasa et al. 2010

M. cordata R.Br. (calli) Iwasa et al. 2010

Os extratos antociânicos são também muito apelativos para a produção de metabolitos secundários em estudos de cultura in vitro. São pigmentos naturalmente produzidos pelas plantas, frutos e vegetais com um grande potencial antioxidante, apresentando também outras bioatividades tais como antitumoral, anti-inflamatória e antimutagénica (Kong et al., 2003). Konczak-Islam et al. (2003) e Konczak-Islam et al. (2005) obtiveram concentrações elevadas de antocianinas acetiladas em calli de Ipomoea

batatas L. cv Ayamurasaki após transferência para um meio próprio para a produção de

antocianinas. Neste mesmo estudo, os ácidos clorogénico e cafeico foram também identificados como os compostos fenólicos maioritários. Por outro lado, Barros et al. (2012) detetaram a produção de antocianinas num clone obtido de partes vegetativas de

Coriandrum sativum L. no mesmo meio MS onde os restantes clones foram também

produzidos, sugerindo que a produção de antocianinas pode ser afetada pelas condições ambientais ou stresse fisiológico da cultura in vitro. Longo et al. (2007) focaram-se somente na produção e caraterização de antocianinas em rebentos de Eugenia myrtifolia Sims, observando que esta planta produz somente uma forma molecular de malvidina, uma das antocianinas mais comuns em plantas superiores (Kong et al., 2003), podendo ser usada como modelo para o estudo das vias biossintéticas destes compostos.

As betalaínas são também pigmentos usados como corantes alimentares, apresentando um elevado potencial antioxidante devido à presença de grupos hidroxilo fenólicos na sua estrutura. Georgiev et al. (2010) estudaram a composição fenólica em extratos de betalaínas excretados para o meio de cultura por raízes transgénicas de Beta

vulgaris cv. Detroit Dark Red, observando que estes extratos apresentavam maior atividade

antioxidante que o material vegetal inicial, concluindo sobre a existência de efeitos sinergísticos entre as betalaínas e os concomitantes compostos fenólicos. Dubravina et al. (2005) focaram-se na produção de compostos fenólicos flavanois em calli de Taxus baccata L. e T. Canadensis Marsh. durante o período de um ano, notando um aumento significiativo destes compostos em condições que mimetizam o verão, e também durante a diferenciação dos tecidos. Isawa et al. (2010) obtiveram compostos fenólicos tetra-hidroprotoberberinas a partir de tecido de calli de Corydalis ochotensis var. raddeane, Macleaya cordata R.Br e

Nandina domestica Thunb, importantes pela sua atividade antimalária e, por isso, apelativos

para a indústria farmacêutica. Os ácidos fenólicos são também um grupo de compostos que demonstram uma alta potencialidade fitoquímica devido às suas caraterísticas biológicas. Thiem et al. (2013) estudaram a produção de ácidos fenólicos em raízes transgénicas e rebentos de Eryngium planum L., observando níveis elevados de ácidos cafeico e clorogénicos, mas sobretudo, ácido rosmarínico excretado pelas raízes (procedimento de extração facilitado). Szopa & Ekiert (2012) encontraram também níveis elevados de ácidos

chinensis (Turcz.) Baill., aumentando o valor fitoquímico desta planta. Alemanno et al.

(2003) estudaram estaminóides e anteras de Theobroma cacao L. descobrindo que a cultura

in vitro é uma técnica fiável para a manutenção e multiplicação de clones de alta produção

desta planta, identificado também três ácidos fenólicos derivados de amidas de ácidos hidroxicinâmicos, nunca antes identificados em tecidos originais.

Todos os estudos acima mencionados referem-se a extratos fenólicos. No entanto, há já muitos estudos que estão já focalizados para a produção e extração de compostos fenólicos individuais que possam ter caraterísticas bioativas interessantes. Na Figura 5 estão representados esquematicamente alguns compostos fenólicos individuais produzidos em cultura de células vegetais. Como foi dito anteriormente, os ácidos fenólicos são um grupo de compostos que incitam os investigadores pelas suas propriedades bioativas. A maioria dos estudos são direcionados para a produção destes compostos. Chen et al. (1999) estudaram a produção de ácido litospémico B (3a) e ácido rosmarínico (3b) em raízes transgénicas de Salvia miltiorrhiza Bunge, enquanto Rady & Nazif (2005) produziram ácido rosmarínico em rebentos de Ocimum americanum L. var pilosum, pelo seu potencial bioativo. O ácido o-coumárico glicosilado (3c) e o ácido cinâmico glicosilado (3d) foram ambos produzidos numa suspensão celular de Rauwolffia serpentine Benth. E Kurz para comprovar a atividade de glicolisação desta planta in vitro (Schroeder et al., 1996). Schroeder et al. (1996) também isolaram piceina (3e), composto relacionado com a marcação de danos físicos nos tecidos celulares das plantas. Sircar et al. (2007) usaram o sistema de raízes transgénicas para a produção de ácido p-hidroxibenzóico (3f) em Daucus

carota L. mostrando que a acumulação deste composto ocorre no citosol e na parede

celular, sendo por isso um modelo promissor para o estudo biossintético deste compostos. Por outro lado, o ácido cafeoilquínico (3g) foi produzido em plântulas e calli de Solidago

graminifoli L. e Solidago virgaurea L., plantas tradicionalmente usadas na Polónia pela

maioria da população pelas suas caraterísticas medicinais que podem ser atribuídas à presença de ácidos fenólicos (Thiem et al., 2011). No mesmo estudo, um éster fenólico glicosilado, leiocoposídeo (3h) foi também isolado, demonstrando a atividade urológica deste compostos, e por isso com grande interesse de ser produzido em larga escala (Thiem et al., 2011).

Com menos significado numérico, mas com importância bioativa, a classe dos flavonoides, especialmente flavonas, são também alvos para a produção e isolamento em sistemas de cultura in vitro. Nishikaw et al. (1999) produziram um derivado de flavona (3i, 5,2'-di-hidroxi-6,7,8,3'-tetrametoxiflavona) em sistema de raízes transgénicas de Scutellaria

baicalensis Georgi, tradicionalmente usadas pelas suas raízes para o tratamento da

hepatite, tumores, diarreia e doenças inflamatórias. Shinde et al. (2010) também isolaram uma isoflavona numa cultura de calli de Psoralea corylifolia L. testando-a pela sua atividade

antioxidante, que foi maior sob condições de luz constante, sendo correlacionada com a maior presença de isoflavona. Por outro lado, Yang et al. (2001) isolaram uma isoflavona (3j) em calli de Mirabilis jalapa L. pela sua atividade antifúngica contra Candida albicans. Neste estudo, um segundo composto foi também isolado (desidro-rotenóide, 3k) também com atividade antifúngica. Ziaratnia et al. (2009) isolaram um novo composto em cultura de calli de Helichrysum aureonitens L. Moench, clorofenol (3l), que foi testado pela sua atividade antitumoral e antituberculose. Os autores reconheceram a necessidade de estudos futuros para avaliar o seu potencial como molécula anticancerígena. Finalmente, Pinhatti et al. (2010) isolaram dois novos compostos fenólicos nas partes aéreas de Hypericum ternum A. St Hill, hiperosídeo e uliginosina (3m), observando que os níveis produzidos in vitro são significativamente mais elevados do que nas plantas silvestres, sendo necessária uma otimização do método para produzir estes compostos farmacologicamente pretendidos.

Figura 5. Exemplos de alguns compostos fenólicos individuais produzidos por técnicas de cultura in vitro: a) ácido litospémico B; b) ácido rosmarínico; c) ácido o-coumárico glicosilado; d) ácido