Mise en œuvre des filtrations

Les expériences de filtration ont été réalisées à température ambiante et sous un poste de sécurité microbiologique type II (Jouan, MSC-12) à l’aide du montage expérimental présenté sur la figure II.12.

MEMBRANE Bouteille d’air comprimé Manomètre détendeur Capteur de pression Agitateur magnétique Balance électronique PERMEAT SUSPENSION BACTERIENNE Réservoir MEMBRANE Bouteille d’air comprimé Manomètre détendeur Capteur de pression Agitateur magnétique Balance électronique PERMEAT SUSPENSION BACTERIENNE Réservoir

figure II.12 : Dispositif expérimental de filtration frontale.

Ce dispositif comprend une cellule agitée de filtration frontale de type Amicon (Model 8050) reliée à un réservoir d’alimentation pressurisé (Sartorius, 5L). La cellule de filtration contient l’une des membranes sélectionnées précédemment.

Ce type de montage a été choisi en raison de sa taille réduite qui autorise une désinfection aisée de l’ensemble avant chaque expérience ainsi que la mise en œuvre de manipulations sous poste de sécurité microbiologique afin d’éviter la contamination du système par les microorganismes environnants.

Le montage est alimenté par une bouteille d’air comprimé et deux détendeurs successifs (AGA et Air liquide) permettent d’ajuster la pression appliquée. Celle-ci est par ailleurs

mesurée à l’aide d’un capteur de pression (Keller, ± 0,01 bar). La vitesse d’agitation dans la cellule est maintenue à 300 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique placé sous celle-ci (Heidolph MR 3000 D). Le volume de perméat récupéré est évalué ponctuellement par pesée à l’aide d’une balance électronique (Adventurer Ohaus, ± 0,01 g). Cette mesure permettra de suivre l’évolution du flux de perméat au cours de la filtration.

La gamme de pression transmembranaire utilisée (0,2 à 1,0 bar) a été choisie en regard des pressions utilisées sur site de production d’eau potable. Quant à la durée des filtrations, elle répond au compromis à trouver entre la viabilité des cellules bactériennes (inférieure à 24 h en l’absence de milieu nutritif) et le temps nécessaire à l’établissement, voire la stabilisation, des phénomènes de transfert que l’on cherche à observer (plusieurs heures au minimum).

Par ailleurs, quelques essais ont été effectués sans pression transmembranaire mais sous l’action d’une autre force : un gradient de concentration en substances nutritives. Il s’agit des essais dits « en statique » par opposition aux essais dynamiques de filtration. Ces essais sont inspirés de l’étude réalisée par Hasegawa et al. (2003).

Après avoir désinfecté la membrane, celle-ci est placée sur un milieu nutritif solide (gélose trypcase soja) puis 10 µl de suspension bactérienne à 104 _{UFC/mL sont déposés au centre}

de la membrane. Afin de contrôler la température sur la durée de l’essai, l’ensemble est mis à l’étuve (ici à 22,5 ± 2 °C). Après plusieurs jours, la membrane est retirée et la boite de gélose est alors incubée à 37 °C ± 2 °C en aérobiose pendant 24 h. Lors de la lecture des résultats, la croissance de colonies bactériennes au centre de la boite est considérée comme résultant d’un transfert des microorganismes à travers la structure poreuse de la membrane. A noter que les résultats obtenus par cette méthode sont uniquement qualitatifs.

2.2.2. Protocole des essais

Le protocole détaillé mis en œuvre au cours de chaque essai de filtration est indiqué en annexe 4. Seule ici est présentée une synthèse des étapes les plus significatives.

La première étape de chaque filtration consiste à désinfecter la structure poreuse de la membrane. Pour cela, celle-ci est immergée dans une solution d’hypochlorite de sodium à 200 ppm (obtenue à partir d’eau de javel à 36 °) pendant 20 minutes puis rincée abondamment à l’eau distillée stérile. De plus, une membrane neuve est utilisée pour chaque essai afin d’éviter les contaminations croisées.

Par ailleurs, la cellule de filtration est immergée dans une solution d’hypochlorite de sodium à 1000 ppm pendant 30 minutes tandis que les autres éléments du système sont autoclavés (20 minutes à 120 °C) avant utilisation.

La nécessité de travailler avec du matériel stérile est un argument supplémentaire en faveur du choix de membranes planes pour notre étude en raison de la mise en œuvre aisée d’un protocole de désinfection pour ce type de membranes.

Suite à la phase de désinfection, l’expérience de filtration proprement dite est réalisée en quatre étapes. Dans un premier temps, de l’eau distillée stérile est filtrée à travers la membrane à une pression transmembranaire de 1,5 bar. Cette étape de compactage est achevée lorsque le flux de perméat est stabilisé (après 1 heure de filtration environ). Elle permet l’obtention d’une membrane dont la structure n’évoluera plus avec les variations de pression transmembranaire.

La perméabilité à l’eau initiale de la membrane est alors déterminée par des mesures de flux à l’eau distillée stérile à différentes pressions transmembranaires (0,25 - 0,5 - 1,0 bar). Ensuite, le réservoir d’alimentation est vidé puis rempli avec 5 L de la suspension bactérienne à filtrer. A noter que si le volume de suspension introduit dans le réservoir est toujours de 5 L, le volume effectivement filtré dépend des conditions opératoire mises en œuvre (pression transmembranaire, durée de l’essai, perméabilité de la membrane). Toutefois, pour chaque essai, le volume effectivement filtré est indiqué sur les courbes présentant les différents résultats expérimentaux. Un prélèvement est effectué dans le

réservoir d’alimentation en début et en fin de filtration, afin de déterminer précisément la concentration de la suspension d’alimentation mais aussi de vérifier la stabilité de celle-ci sur la durée de l’essai. En cours de filtration, des échantillons de perméat sont prélevés régulièrement (au minimum toutes les 30 minutes). A noter que la configuration de la cellule de filtration ne nous permet pas de réaliser des prélèvements de rétentat sans perturber fortement le système (dépressurisation). Par conséquent, la seule concentration en bactéries dans le rétentat accessible expérimentalement est celle correspondant à l’échantillon prélevé en fin de filtration.

Enfin, lorsque la filtration est terminée, le réservoir d’alimentation est à nouveau vidé et rempli par de l’eau distillée stérile de façon à mesurer la perméabilité à l’eau finale de la membrane de manière à évaluer le pouvoir colmatant de la suspension.

Conclusion

Ce chapitre nous a permis de présenter l’ensemble du matériel et des méthodes nécessaires à l’étude des mécanismes de transfert des bactéries à travers la structure poreuse de membranes de filtration.

Ainsi, à coté des techniques classiquement employées en microbiologie et/ou en filtration membranaire, cette étude a nécessité la mise en œuvre de techniques plus spécifiques telles que celles permettant de générer des défauts calibrés et présentant des caractéristiques variées.