Mise en œuvre des CSPs sur le monolithe NAS-co-EDMA

V.3.1.Elaboration des supports monolithes NAS-co-EDMA en capillaire

Le monolithe NAS-co-EDMA est obtenu en reprenant les conditions décrites dans les travaux du

Dr M. Guerrouache. Ainsi les colonnes de silice (TSU, Polymicro Technologies), de diamètre interne

de 75 µm et de diamètre externe de 375 µm, subissent un prétraitement par l’agent de silanisation

γ-MAPS afin de bien fixer le monolithe aux parois internes du capillaire.

Pour cela, nous activons une longueur de 2 mètres de capillaire en y percolant la soude (1 M) durant

une heure à faible pression. Le capillaire est bouché à ses extrémités et placé dans un four GC à 100°C

durant 2 heures. Le capillaire est ensuite rincé successivement par HCl (0,1M), H

2

O durant 10

minutes et à l’acétone durant 15 minutes. Le capillaire est séché sous un flux d’azote à 120°C durant

2 heures. Une solution de γ-MAPS à 30% (v/v) dans le toluène, fraichement préparée, est percolée

dans le capillaire quelques minutes, puis le capillaire est bouché à ses extrémités et laissé toute une

nuit à l’abri de la lumière à température ambiante. Le capillaire vinylisé est rincé au toluène durant

15 minutes et séché par l’azote durant une heure à température ambiante avant d’être conservé à 4°C.

Le monolithe est synthétisé in-situ par polymérisation radicalaire thermique et photochimique. Un

mélange de prépolymérisation contenant 4 mg d’AIBN, 200 mg de NAS, 110 µL d’EDMA et 700 µL

de toluène est maitenu aux ultrasons quelques minutes puis filtré sur membrane de PTFE (0,45µm).

Le mélange est dégazé par un flux d’azote pendant 10 minutes avant d’être rempli avec le Nanobaum

dans les colonnes prédécoupées. Les colonnes sont placées 800 s dans une enceinte UV contenant

6 lampes de 15 Watts irradiant à 365 nm, avec un ruban adhésif noir anti-UV recouvrant les longueurs

non effectives. Le protocole de polymérisation photochimique a été adapté avec un four UV Dymax

162

de 400 Watts. Ainsi la durée de réaction est écourtée (1-10 mn) tandis que la voie thermique préconise

une réaction de plusieurs heures à 60°C dans un bain-marie. Les colonnes sont ensuite rincées à forte

pression à l’acétonitrile durant 1 heure

V.3.2.CSPs obtenues avec la stratégie de greffage covalent

V.3.2.1. Mise en œuvre de la CSP1

Après avoir obtenu le monolithe après polymérisation photochimique ou thermique, nous mettons en

place la stratégie du couplage du p-CD

-

utilisée en OT-CEC avec les agents de couplages EDC/NHS.

Ainsi nous utilisons un nanobaume pour rincer la colonne à haute pression avec l’acétonitrile pendant

1 heure (30-50 bars) avant de la fonctionnaliser avec l’EDA pris à 0,1 M puis à 0,25 M diluée dans

l’acétonitrile. Le pH basique en sortie de capillaire est vérifié avec du papier pH. Au bout de

30 minutes de percolation de l’EDA, nous remarquons que la colonne est moins perméable.On rince

ensuite la colonne à l’acétonitrile pendant 30 minutes à forte pression afin d’éliminer l’excès de réactif

présent. La colonne est rincée par un électrolyte tampon Tris au pH=8,0 durant 1 heure à forte

pression. Le p-CD

^-

, en solution aqueuse, à 1 g.L

^-1

est mis sous agitation, 90 minutes, à une

température inférieure à 15°C en présence de 10 mM en EDC et 10 mM en NHS. Le mélange

polymère est percolé dans la colonne (NAS-co-EDMA)-EDA pendant 1 heure à forte pression

(50-60 bars). La colonne est laissée au repos durant 2 heures avant d’être à nouveau rincée successivement

par l’eau distillée et l’électrolyte tampon d’analyse.

V.3.2.2. Mise en œuvre de la CSP2

De la même manière que pour le greffage du p-CD

-

, nous avons greffé avec EDC/NHS la

succinyl-β-cyclodextrine (Scc-β-CD, 1 g.L

-1

) et la carboxyméthyl-β-cyclodextrine (CM-β-CD, 0,5 g.L

^-1

) sur

des colonnes monolithes (NAS-co-EDMA) obtenues par photopolymérisation durant 5 minutes au

Dymax (source UV 400 watts) et modifiées par l’EDA.

V.3.2.3. Mise en œuvre de la CSP3

La CSP

3

est obtenue en fonctionnalisant la colonne NAS-co-EDMA par l’allylamine diluée à 1 M

dans l’acétonitrile durant 2 heures. Ensuite, la colonne est rincée successivement par l’acétonitrile et

le méthanol durant 1 heure. Une réaction de type « click-chemistry » avec la cystéamine sur les

groupes vinyliques de l’allylamine nous permet d’augmenter la taille de l’espaceur reliant le p-CD

-

.

Ainsi un vial contenant 151,3 mg de cystéamine hydrochlorée et 3,5 mg d’amorceur DMPA dans

2 mL d’éthanol absolu est mis au sonicateur durant 5 minutes, puis dégazé. Les réactifs sont ensuite

percolés dans la colonne et irradiés au même moment à 365 nm durant 1 heure. La colonne est rincée

163

à l’éthanol et à l’eau distillée. Le couplage du p-CD

-

s’effectue dans les mêmes conditions que pour

la CSP

1.

V.3.2.4. Mise en œuvre de la CSP4

Une solution aqueuse d’Heptakis (6-amino-6-déoxy)-β-cyclodextrine (β-CD-(NH

2

)

7

,7HCl)

heptahydrochlorée préparée à 10 g.L

^-1

est percolée durant une nuit dans le capillaire NAS-co-EDMA

obtenu de façon thermique. La CSP est ensuite rincée à forte pression avec l’électrolyte tampon

d’analyse en m-CEC.

V.3.3.CSPs obtenues avec la stratégie d’immobilisation électrostatique

V.3.3.1. Mise en œuvre de la CSP5

Le greffage non-covalent du p-CD

⁺

se fait en percolant hydrodynamiquement, à forte pression durant

1 heure, une solution aqueuse contenant le polymère cationique à une concentration de 1 g.L

^-1

dans

la colonne monolithe obtenue en voie thermique. La colonne résultante présente un FEO anodique

mais elle ne présente aucune énantiosélectivité vis-à-vis des racémiques injectés.

V.3.3.2. Mise en œuvre de la CSP6

La CSP

6

est obtenue en fonctionnalisant la colonne NAS-co-EDMA par l’allylamine diluée à 1 M

dans l’acétonitrile durant 2 heures. Ensuite, la colonne est rincée successivement par l’acétonitrile et

l’éthanol absolu durant 1 heure. Une réaction de type « click-chemistry » avec l’acide

mercaptosuccinique sur les groupes vinyliques de l’allylamine a lieu. Ainsi un vial contenant 150 mg

d’acide mercaptosuccinique et 3,5 mg d’amorceur DMPA dans 2 mL d’éthanol absolu est mis au

sonicateur durant 5 minutes, puis dégazé. Les réactifs sont ensuite percolés dans la colonne et irradiés

au même moment à 365 nm durant 1 heure. La colonne est rincée à l’éthanol et à l’eau distillée.

V.3.3.3. Mise en œuvre de la CSP7

La CSP

7

est obtenue en fonctionnalisant la colonne NAS-co-EDMA par l’allylamine diluée à 1 M

dans l’acétonitrile durant 2 heures. Ensuite, la colonne est rincée successivement par l’acétonitrile et

le méthanol absolu durant 1 heure. Une réaction de type « click-chemistry » avec l’acide

mercaptoéthane sulfonate sur les groupes vinyliques de l’allylamine est mise en œuvre. Ainsi un vial

contenant 60 mg de mercaptoéthane sulfonate et 1,5 mg d’amorceur DMPA dans 2 mL de méthanol

absolu est mis au sonicateur durant 5 minutes, puis dégazé. Les réactifs sont ensuite percolés dans la

colonne et irradiés au même moment à 365 nm durant 1 heure. La colonne est rincée au méthanol

164

puis à l’eau distillée. La CSP

7

est obtenu en percolant hydrodynamiquement, à forte pression durant

1 heure, une solution aqueuse contenant le polymère cationique à une concentration de 10 g.L

^-1

dans

la colonne.La colonne 6a36-allylamine-mercaptoéthanesulfonate-pCD

⁺

n’a pu être utilisée en CEC

car elle a été bouchée lors de la fonctionnalisation dynamique par le polymère cationique de

triméthylammonium-β-CD à 10 g.L

^-1

.

Annexes

Dans le document Conception et évaluation de phases stationnaires chirales pour l'emploi en électrochromatographie capillaire ( Tubes ouverts et colonnes monolithes ) (Page 162-165)