Effet du couplage du p-CD - en milieu organique avec TBTU/TEA

Afin d’optimiser le couplage des sélecteurs chiraux dans nos colonnes silanisées par l’APTEOS, nous

avons couplé en milieu non aqueux, le polymère anionique p-CD

^-

à l’aide d’un sel d’uronium (TBTU)

et en présence d’une base triéthylamine (TEA) sur des colonnes gravées et modifiées par des amines

primaires. Les colonnes ont ensuite été testées en injectant les racémiques tests. La confirmation de

l’immobilisation du p-CD

-

en surface nous est donnée par la séparation chirale de certains

énantiomères. En nous inspirant de quelques travaux utilisant des sels d’uronium dans le couplage

peptidique, nous avons gardé le polymère à 1g.L

^-1

et pris le TBTU à 10 mM et le TEA à 30 mM dans

l’acétonitrile à température ambiante. Nous avons ensuite fait varier les proportions des réactifs et du

polymère dans le couplage dans le but d’optimiser la CSP.

Tableau XXIX : Paramètres chromatographiques en OT-CEC sur CSP obtenue avec le p-CD

^-

(1 g.L

-1

) greffé sur colonnes gravées. TBTU/TEA pris à 10 mM et 30mM respectivement Tampon

phosphate pH=8,3 10mM I=10mM, T=20°C, L

tot

=31,2cm.

Tableau XXX : Paramètres chromatographiques en OT-CEC sur CSP obtenue avec le p-CD

^-

(40,6 g.L

^-1

) greffé sur colonnes gravées avec TBTU/TEA pris à 220 mM et 600mM respectivement.

Tampon phosphate pH=8,3, 10mM I=10mM, T=20°C, L

tot

=31,2cm.

Nous pouvons observer dans le tableau XXIX, que la CSP obtenue en milieu organique permet

uniquement de séparer partiellement la 7-méthoxyFlavanone et de façon correcte le propranolol avec

de très bonnes résolutions et énantiosélectivités. De plus, les rétentions des racémiques ne sont pas

très différentes de celles obtenues avec le couplage en milieu aqueux (EDC/NHS). Dans le tableau

XXX, nous n’observons en revanche aucune sélectivité des racémiques injectés et les rétentions sont

très faibles. Il est probable que la base triéthylamine, prise à haute concentration, hydrolyse le

polymère de CD et détruise le greffage de la phase stationnaire. Ce nouveau couplage de la p-CD

-

sur

CSP p-CD

-

« etched » k

1

k

2

α Rs N (m

-1

)

6-hydroxyflavanone 0,19 0,19 1,00 - 10838

7-méthoxyflavanone 0,37 0,38 1,03 1,57 1556186

Flavanone 0,20 0,20 1,00 - 4678

HPPH 1,02 1,02 1,00 - 13121

Ephédrine 1,15 1,15 1,00 - 53860

Noréphédrine 1,12 1,12 1,00 - 32563

Propranolol 0,64 1,32 1,99 9,93 15096

CSP p-CD

-

« etched » k

1

k

2

α Rs N (m

-1

)

7-méthoxyflavanone 0,10 0,10 1,00 - 1145

Flavanone 0,08 0,08 1,00 - 4646

124

les amines primaire employant un sel d’uronium nécessite l’emploi de réactifs à faibles

concentrations.

Conclusion

Dans ce chapitre, nous avons développé une stratégie de gravure de la surface interne de nos

capillaires à tubes ouverts dans le but premier d’augmenter la surface spécifique et d’améliorer

considérablement la qualité de nos électrochromatogrammes chiraux par rapport à ceux obtenus dans

la précédente thèse en OT-CEC chirale sur des colonnes à tubes ouverts non gravées. Les CSPs

décrites dans ce chapitre utilisent une nouvelle voie simple, rapide et efficace pour la conception de

phases stationnaires chirales en OT-CEC. Ces CSPs sont obtenues en couplant de manière peptidique

avec EDC et NHS, en milieu aqueux, un sélecteur chiral à base de polymère de p-CD

-(polycarboxyméthyl-β-cyclodextrine), ou bien à base de monomères de CM-β-CD

^-

(carboxyméthyl-β-cyclodextrine) ou Scc-β-CD (succinyl-(carboxyméthyl-β-cyclodextrine) sur des amines primaires gréffées en

surface de la silice. Cette réaction sur nos colonnes gravées permet de lier chimiquement le sélecteur

chiral sur une grande surface interne et de rendre ainsi biocompatible et plus stables les colonnes

synthétisées pour des analyses de racémiques neutres et chargés. Nous avons pu observer durant ces

travaux que, la stratégie de gravure par NH

4,

HF

2

lors de l’élaboration des CSPs est une étape très

laborieuse et délicate de par le fait de la précipitation du sel de bifluorure d’ammonium lors de la

percolation à forte pression de celui-ci dans nos colonnes à température ambiante. Des étapes de

procédés thermiques à hautes températures sont donc nécessaires au succès de la gravure de nos

capillaires de silice. Ces étape sont cruciales dans la fabrication de nos CSPs puisque nous avons pu

observer de grandes variations des rétentions et autres paramètres électrochromatographiques sur

certaines colonnes gravées employant le polymère et le monomère de CM-β-CD. Des études

confirment la sensibilité de la température lors de la gravure des capillaires, notamment par

l’augmentation d’un facteur 10 de la rétention d’un soluté lorsque la température de gravure varie de

100°C. Il est donc impératif de bien contrôler le temps de réaction et la température lors de l’étape

employant l’agent de gravure (NH

4,

HF

2

) afin de reproduire des colonnes répétables. L’étape de

modification de la surface par des amines primaires est la seconde étape dans l’élaboration de nos

CSPs. Cette étape s’est faite en milieu organique dans nos travaux. Cependant on trouve dans la

littérature une possibilité d’effectuer le greffage de l’aminopropyltriéthoxysilane en milieu

hydro-organique offrant ainsi une plus grande surface spécifique, une meilleure stabilité hydrolytique et de

meilleures reproductibilités. Ainsi les résolutions, les efficacités et les caractéristiques rétentives des

solutés injectés seraient de meilleures qualités. Il conviendrait de tester le greffage de l’APTEOS dans

un milieu hydro-organique employant des précurseurs silanes comme l’APTEOS. Il est tout de même

125

important de bien contrôler l’acidité du milieu pour éviter la dissolution de la silice et toutes attaques

nucléophiles des amines sur les siloxanes.

Nous avons caractérisé, par des techniques d’analyses (AFM, MEB, OT-CEC), chaque étape de la

conception de nos colonnes, depuis la gravure jusqu’au greffage covalent des sélecteurs chiraux dans

les colonnes en tubes ouverts. Nous avons par la suite varié le mode opératoire de la synthèse de nos

CSPs et les conditions d’analyse en OT-CEC afin d’optimiser la technique de greffage et mieux

comprendre les interactions mises en jeu entre les solutés racémiques injectés et les différentes CSPs

élaborées. Il s’avère que la gravure des capillaires nous a permis de séparer quelques racémiques

cationiques que nous ne séparions pas sur la mêmes CSP issues de colonnes non gravées. Cette

stratégie, une fois maitrisée, permet d’augmenter considérablement les efficacités, les résolutions et

le phénomène de rétention des racémiques neutres et chargés. Les meilleures conditions opératoires

semblent être de travailler à une température inférieure à 20°C, de faibles différences de potentiel

appliquées lors de nos analyses en OT-CEC chirale et de garder un électrolyte totalement aqueux

pour favoriser l’inclusion hydrophobe de nos solutés dans la cavité des β-cyclodextrines. Les

monomères chiraux utilisés ne sont pas élués lors de nos analyses puisque le greffage des oligomères

nous permet aussi de séparer quelques racémiques. La faible masse des monomères de β-CD offre

l’avantage d’obtenir de meilleures efficacités en OT-CEC, cependant les meilleures sélectivités sont

obtenues avec le polymère p-CD

^-

. Le couplage de p-CD

^-

est réalisable également en milieu organique,

cependant nous ne séparons que le propranolol et partiellement la 7-méthoxyFlavanone avec le

couplage employant TBTU/TEA. De plus, il convient d’utiliser le sélecteur chiral et les agents à

faibles concentrations afin de favoriser la solubilité du milieu réactionnel et éviter que la forte base

détruise la phase stationnaire.

Parmi les racémiques injectés dans nos colonnes à base de p-CD

-

, nous n’avons pas observé

d’énantiosélectivité pour le MPH, la kétamine, l’oxyphéncyclimine, la terbutaline, la cinchonidine et

la carbinoxamine. Nous n’avons pas observé d’énantiosélectivité non plus pour l’homosérine, la

phénylglycine, la proline et la thréophénylsérine. Une explication probable serait que les solutés

cationiques intéragissent avec les charges des groupements chimiques apportées par les différentes

étapes de mise en œuvre de la CSP de manière à ce que les solutés ne soient pas inclus dans la cavité

de la cyclodextrine dans un milieu totalement aqueux. Il conviendrait peut être de changer la nature

de l’électrolyte d’analyse sur cette CSP ou de changer la nature du sélecteur chiral greffé.

126

CHAPITRE III : PHASES STATIONNAIRES

Dans le document Conception et évaluation de phases stationnaires chirales pour l'emploi en électrochromatographie capillaire ( Tubes ouverts et colonnes monolithes ) (Page 124-127)