Caractérisation du greffage du p-CD - en CEC avec et sans agents de couplages EDC/NHS

couplage EDC/NHS

Afin de nous assurer que le polymère anionique (p-CD

-

) n’est pas juste adsorbé en surface du

capillaire modifié par des amines primaires chargés positivement, nous décidons de tester le pouvoir

énantioséparatif d’une colonne obtenue sans y ajouter les agents de couplage EDC et NHS. Nous

faisons percoler le polymère de CD dans une colonne modifiée par l’APTEOS sans les agents de

couplages péptidiques et effectuons des mesures du FEO avec le DMF comme marqueur dilué dans

l’électrolyte d’analyse dans un premier temps et injectons par la suite une liste de racémiques dilués

dans le méthanol (Tableau VII).

Figure 63 : Schéma de la synthèse de la CSP en

tubes ouverts à base de p-CD

-

avec les agents

EDC/NHS en milieu aqueux et à température

ambiante.

Figure 64 : Schéma de synthèse de la CSP

en tubes ouverts à base de CM-β-CD

^-

avec

les agents EDC/NHS en milieu aqueux et à

température ambiante.

107

Tableau VII :

Test du

greffage du

p-CD

^-

en absence

des agents de

couplage

EDC/NHS,

dans tampon

électrolyte Tris

à 10mM et

pH=7,4,

injection à

0,3psi 2s et

∆V= +15kV,

T=20°C.

La valeur du FEO obtenu avec le marqueur DMF nous indique µ

eof

=2,69*10

^-8

m².V

^-1

.s

^-1

avec une

bonne répétabilité de la mesure (CV=6,7%). La rétention moyenne pour le soluté

7-méthoxyflavanone dans le cas de la stratégie sans les agents de couplage est petite (k=0,12) avec un

coefficient de variation (% CV) égale à 26,3%. Pour le HPPH, la rétention est aussi faible (k=0,11)

avec un coefficient de variation égale à 10,7%. Le BNP anionique, ayant une vitesse électrophorétique

dans le sens inverse du FEO, présente également de faibles rétentions (k=1,21 ; CV=4,9%). On

remarque ainsi que dans l’électrolyte Tris à pH=7,4, les racémiques neutres et le BNP présentent de

faibles rétentions et sont donc peu retenus par la phase stationnaire. Les électrochromatogrammes des

racémiques injectés sur les colonnes issues de la stratégie sans agents de couplage sont présentés

ci-dessous :

Echantillon ^{Concentration}

(mol.L

-1

) x10

-3

t

eo

(min)

t

r

(min)

µ

eof

x10

-8

(m².V

-1

.s

-1

)

DMF 6,46 2,61 2,72

DMF 6,46 2,57 2,77

DMF 12,9 2,76 2,57

DMF 12,9 2,52 2,82

DMF 12,9 2,47 2,88

DMF 12,9 2,97 2,39

7-méthoxyFlavanone 0,20 2,48 2,84 2,87

7-méthoxyFlavanone 0,39 1,97 2,13 3,61

7-méthoxyFlavanone 0,39 2,17 2,37 3,27

7-méthoxyFlavanone 0,39 2,34 2,55 3,04

7-méthoxyFlavanone 1,97 2,50 2,83 2,84

7-méthoxyFlavanone 1,97 2,40 2,80 2,96

7-méthoxyFlavanone 1,97 2,47 2,77 2,88

7-méthoxyFlavanone 3,93 2,39 2,76 2,97

HPPH 0,37 1,97 2,15 3,61

HPPH 0,37 1,95 2,19 3,64

HPPH 0,37 2,01 2,25 3,54

HPPH 1,87 2,03 2,24 3,50

HPPH 1,87 2,05 2,29 3,47

HPPH 1,87 2,04 2,26 3,48

BNP 0,29 2,02 4,33 3,52

BNP 0,29 2,08 4,63 3,42

BNP 0,29 2,10 4,74 3,38

108

Figure 65 : Electrochromatogrammes du racémique 7-méthoxyFlavanone pris à 0,1g.L

^-1

et 0,5g.L

^-1

en OT-CEC sur colonne modifiée par APTEOS et p-CD

^-

sans agent de couplage. Electrolyte tampon

Tris pH=7,4 10mM, T=20°C, injection 0,3psi 2s, ∆V=+15kV.

Figure 66 : Electrochromatogrammes du racémique HPPH pris à 0,1g.L

^-1

et 0,5g.L

^-1

en OT-CEC sur

colonne modifiée par APTEOS et p-CD

^-

sans agent de couplage. Electrolyte tampon Tris pH=7,4

10mM, T=20°C, injection 0,3psi 2s, ∆V=+15kV.

Figure 67 : Electrochromatogramme du racémique BNP pris à 0,1g.L

^-1

en OT-CEC sur colonne

modifiée par APTEOS et p-CD

^-

sans agent de couplage. Electrolyte tampon Tris pH=7,4 10mM,

T=20°C, injection 0,3psi 2s, ∆V=+15kV.

0,1 g/L 0,5 g/L 0,1 g/L 0,5 g/L 0,1 g/L

109

Bien que d’un jour à l’autre la valeur du FEO du tableau VII ne varie pas sur les colonnes élaborées

sans la présence de EDC et NHS (CV= {0,02-0,09}), indiquant une certaine stabilité de la phase

stationnaire, on ne remarque aucune énantiosélectivité des solutés chiraux tels que la

7-méthoxyflavanone, l’HPPH et le BNP sur les électrochromatogrammes ci-dessous (Figures 65, 66 et

67). On compare ces électrochromatogrammes avec ceux obtenus sur des colonnes non gravées et

modifiées par le p-CD

-

en présence cette fois des agents de couplage EDC/NHS en milieu aqueux.

(Figures 68, 69 et 70).

Figure 68 : Electrochromatogrammes du racémique 7-méthoxyflavanone pris à 0,1g.L

^-1

et 0,5g.L

^-1

en OT-CEC sur colonne modifiée par APTEOS et p-CD

^-

avec agents de couplage. Electrolyte tampon

Tris pH=7,4 10mM, T=20°C, injection 0,3psi 2s, ∆V=+15kV.

Figure 69 : Electrochromatogrammes du racémique HPPH pris à 0,1g.L

^-1

et 0,5g.L

^-1

en OT-CEC sur

colonne modifiée par APTEOS et p-CD

^-

avec agents de couplage. Electrolyte tampon Tris pH=7,4

10mM, T=20°C, injection 0,3psi 2s, ∆V=+15kV.

0,1 g/L

0,1 g/L

0,5 g/L

110

Figure 70 : Electrochromatogramme du racémique BNP pris à 0,1g.L

^-1

en OT-CEC sur colonne

modifiée par APTEOS et p-CD

^-

avec agents de couplage. Electrolyte tampon Tris pH=7,4 10mM,

T=20°C, injection 0,3psi 2s, ∆V=+15kV.

En comparant les résultats obtenus en OT-CEC sur les colonnes avec (Figures 68, 69 et 70) et sans

(Figures 65, 66 et 67) les agents de couplage, on en déduit que le polymère anionique n’est pas

simplement immobilisé en surface des amines primaires par le biais d’interactions électrostatiques

mais bien par un lien chimique. En effet la séparation chirale des racémiques neutres tels que la

7-méthoxyflavanone et le HPPH nécessite le greffage chimique du sélecteur chiral en surface de la

silice modifiée par des amines primaires avec les agents hydrosolubles EDC/NHS. Le soluté

racémique anionique BNP n’est probablement pas séparé en raison des interactions répulsives qu’il

génère avec le sélecteur chiral p-CD

^-

. De plus les faibles rétentions obtenues sur les colonnes

dépourvues des agents EDC et NHS indiquent que c’est le polymère anionique de CD qui est

principalement responsable des intéractions du soluté dans la colonne électrochromatographique.

Lorsque les agents de couplage ne sont pas ajoutés dans le mélange réactionnel, le p-CD

^-

pris à la

concentration massique de 1g.L

^-1

ne peut être immobilisé de façon covalente sur nos colonnes

présilanisées et ne permet pas de séparer les racémiques injectés dedans.

Nous reprenons le procédé du couplage du p-CD

^-

sur des colonnes initialement gravées « etched »

afin d’évaluer l’influence du traitement de gravure sur le FEO et les séparations chirales en OT-CEC

d’une liste de racémiques neutres injectés dans l’électrolyte Tris à pH=7,4 tels que la

7-méthoxyflavanone, la 6-hydroxyflavanone, la flavanone, le HPPH, des solutés cationiques comme le

propranolol, l’éphedrine et la noréphédrine et le BNP comme racémique anionique. Nous ferons

varier par la suite les paramètres comme la nature de l’électrolyte, le pH du milieu, la température

d’analyse et la différence de potentiel appliquée en volt.

111

Dans le document Conception et évaluation de phases stationnaires chirales pour l'emploi en électrochromatographie capillaire ( Tubes ouverts et colonnes monolithes ) (Page 107-112)