Mise en évidence de la coupure de la protéine Ho de S. cerevisiae par Southern-blot

Chez S. cerevisiae, il est possible de suivre l’évolution de la CDB par ScHo au locus MAT, ainsi que sa réparation, par Southern-blot d’une cinétique de coupure dans des souches sauvages surexprimant ScHO (White and Haber, 1990; Aylon et al., 2003). J’ai voulu suivre l’évolution d’une CDB par ScHo chez C. glabrata à chacun des trois locus sexuels, HML, MAT (Maroc et al., 2020) et HMR. Dans ce but, j’ai réalisé une cinétique de coupure dans la souche sauvage HM100 (HMLalpha MATalpha HMRa) (Figure 19), en milieu liquide inducteur, au cours de laquelle j’ai prélevé un échantillon de culture cellulaire à 2H, 4H et 6H d’induction de ScHO. L’ADNg a été extrait et digéré par des enzymes de restriction coupant de part et d’autre de chaque locus sexuel (Figure 19A). Les résultats de ce Southern-blot sont présentés Figure 19B.

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Figure 19. Analyse par Southern-blot de la CDB par ScHo aux locus HML, MAT et HMR dans la souche sauvage HM100. A. Schéma des locus sexuels de la souche HM100, des sondes d’ADN utilisées et des tailles de fragments attendus. Le rectangle bleu

représente la séquence Ya, le rectangle rouge la séquence Yalpha, les rectangles gris et noirs les séquences identiques partagées par les trois locus sexuels, la barre jaune le site Ho sauvage (pas à l’échelle). Les régions des locus HMLalpha, MATalpha et HMRa sont représentées avec les sites de restriction et les tailles de fragments attendus (avec ou sans coupure ScHo). B.

Photographie par chimiluminescence du Southern-blot. Pour HML, l’ADNg a été digéré par

NsbI/PvuII et hybridé avec une sonde correspondant à 409 pb d’une séquence localisée en amont du locus HML et localisée à 361 pb du premier nucléotide du site Ho ; pour MAT, l’ADNg a été digéré par PstI/XhoI, hybridé avec une sonde correspondant à 484 pb d’une séquence localisée en amont du locus MAT et localisée à 262 pb du premier nucléotide du site Ho ; pour

HMR, l’ADNg a été digéré par NcoI/BplI, hybridé avec une sonde correspondant à 617 pb d’une séquence localisée en aval du locus HMR et localisée à 1 241 pb du dernier nucléotide du site Ho. Le résultat du Southern-blot de cinétique de coupure à MAT est issu de (Maroc et al., 2020). L’ADNg digéré du puit « Non induit » correspond à l’ADNg extrait de la souche HM100 portant le plasmide p7.1, cultivée en milieu SC-Rep sur une nuit entière et à partir de laquelle l’induction liquide utilisée pour le reste du Southern-blot a été réalisée.

116 À la suite de l’induction de ScHO et qu’importe la durée de celle-ci ou le locus sexuel étudié, aucune bande correspondant au locus coupé n’est visualisable. Toutefois, lorsqu’il n’y pas d’induction de ScHo, une bande correspondant au locus intact est visible et disparait dès 2H d’induction de ScHo pour HML et MAT, ce qui confirmerait que la coupure aux trois locus sexuels par ScHo soit très efficace. Concernant le locus

HMR, une bande correspondant au locus intact reste visible jusqu’à 6H d’induction. J’ai démontré dans l’article (Maroc et al., 2020) que dans une souche sauvage, des coupures simultanées aux trois locus sexuels peuvent apparaitre et entraîner une absence de matrice pour réparer la coupure de ScHo. Il est possible que si la CDB à un

MTL ne peut être réparée, la résection dégraderait les extrémités ADN de la CDB de

telle sorte que la sonde d’ADN ne pourrait plus s’y hybrider. En effet, il a été montré chez S. cerevisiae que les extrémités d’une CDB par ScHo qui ne peut être réparée étaient plus dégradées que des extrémités d’une cassure réparable (White and Haber, 1990). J’ai donc de nouveau réalisé un Southern-blot d’une cinétique de coupure dans la souche HM100 en choisissant des enzymes de restrictions et une sonde qui permettaient d’étendre la longueur entre le site de coupure de Ho et le site de restriction le plus proche et ce à chacun des trois locus sexuels (Figure 20A). J’ai obtenu exactement le même résultat que précédemment (Figure 20B). Faute de temps, je n’ai pas pu réaliser un nouveau Southern-blot de cinétique de coupure à HMR.

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Figure 20. Analyse par Southern-blot de la coupure double brin par ScHo aux locus HML et MAT dans la souche sauvage HM100. A. Schéma des locus sexuels de la souche HM100, des sondes d’ADN utilisées et des tailles de fragments attendus. Le

rectangle bleu représente la séquence Ya, le rectangle rouge la séquence Yalpha, les rectangles gris et noirs les séquences identiques partagées par les trois locus sexuels, la barre jaune le site Ho sauvage (pas à l’échelle). Les régions des locus HMLalpha et MATalpha sont représentées avec les sites de restriction et les tailles de fragments attendus (avec ou sans coupure ScHo).

B. Photographie par chimiluminescence du Southern-blot. Pour HML, l’ADNg a été digéré par BglII/BglII et hybridé avec une sonde correspondant à 542 pb d’une séquence localisée en amont du locus HML et localisée à 1 119 pb du premier nucléotide du site Ho ; pour MAT, l’ADNg a été digéré par EcoRI/BglII, hybridé avec une sonde correspondant à 1 013 pb d’une séquence localisée en amont du locus MAT et localisée à 2 111 pb du premier nucléotide du site Ho. Le résultat du Southern-blot de cinétique de coupure à MAT est issu de (Maroc et al., 2020). L’ADNg digéré du puit « Non induit » correspond à l’ADNg extrait de la souche HM100 portant le plasmide p7.1, cultivée en milieu SC-Rep sur une nuit entière et à partir de laquelle l’induction liquide utilisée pour le reste du Southern-blot a été réalisée.

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III.4.2 Mise en évidence de la coupure de ScHo aux locus HML et MAT par