III. Résultats
III.5 La communication entre les locus sexuels HML, MAT et HMR chez C. glabrata est
C. glabrata est complexe
Cette partie de ma thèse concerne l’étude de la communication des locus HML et HMR entre eux-mêmes ainsi qu’avec le locus MAT. J’ai cherché à savoir quelle interaction (au cours de la RH) existe-t-il entre le locus HML et les locus MAT et HMR et entre le locus HMR et les locus HML et MAT ? J’ai démontré dans l’article « A single
Ho-induced double-strand break at the MAT locus is lethal in Candida glabrata » que la
CDB par ScHo aux locus HML et HMR n’était pas un contributeur important à la forte létalité observée à la suite de l’expression de ScHO dans une souche sauvage (Maroc et al., 2020). En effet, tant qu’une matrice de réparation inconvertible est présente dans la cellule, une CDB à HML ou HMR n’est pas fortement létale (Maroc et al., 2020). Etant donné que les locus HML et HMR ont besoin d’une matrice de réparation intacte pour être réparés, j’ai cherché à savoir si son utilisation dépendait de sa localisation. J’ai déjà montré dans l’article « A single Ho-induced double-strand break at the MAT locus is
lethal in Candida glabrata » que le locus HML réparait préférentiellement avec le locus MAT alors que le locus HMR réparait préférentiellement avec le locus HML (Maroc et
al., 2020). Toutefois, j’ai voulu savoir plus précisément, est-ce que le locus HML était capable de réparer correctement la CDB s’il n’y a qu’une seule matrice de réparation disponible au locus HMR et non MAT ? A l’inverse, est-ce que le locus HMR était capable de réparer correctement la CDB s’il n’y a qu’une seule matrice de réparation disponible au locus MAT et non HML ?
123 Dans ce but, j’ai construit des souches dans lesquelles le locus HML peut être coupé par ScHo en présence d’une seule matrice de réparation intacte localisée soit à MAT
soit à HMR et vice versa (Souches SL-CG4 (HMLalpha-inc Δmat HMRa), SL-CG5 (Δhml
MAT-alpha-inc HMRa), SL-CG6 (HMLalpha Δmat HMRa-inc) et SL-CG7 (HMLalpha MATa-inc Δhmr)). Les résultats de survie de ces souches à la suite de l’induction de ScHO sont présentés Figure 23 et l’analyse moléculaire des survivants est présentée Tableau 7.
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Figure 23. Survie à la suite de l’induction de ScHO de souches sauvages ou ne pouvant être coupées qu’à HML ou HMR. Sur le gauche, un schéma des locus sexuels de chaque souche est montré avec la survie, à la suite de l’induction de ScHO, correspondante à droite. Le rectangle bleu représente la séquence Ya, le rectangle rouge la séquence Yalpha, les rectangles gris et noirs les séquences identiques partagées par les trois locus sexuels, la barre jaune le site Ho sauvage et la croix le site Ho muté (locus Inc) (pas à l’échelle). Le résultat de survie de la souche BG87 est tiré de (Boisnard et al., 2015) et les résultats de survie des souches SL0A et SL0B sont tirés de (Maroc et al., 2020). Les valeurs d’au moins quatre expériences ont été moyennées, le SEM a été utilisé afin d’estimer l’erreur et la P-value a été calculée en utilisant un test de Wilcoxon. **: P-value<0.01. ns ou NS.: non significatif.
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Table 7. Structure moléculaire des locus HML et HMR à la suite de l’induction de ScHO
Après l’induction de ScHO en milieu solide, les colonies survivantes sont criblées par PCR pour le locus sexuel qui peut être coupé par ScHo. Quand la PCR révèle des colonies mixtes, au moins quatre colonies sont sous-clonées afin d’obtenir le pourcentage de changement de type sexuel qui est calculé comme ceci : le ratio du nombre de colonies survivantes pures qui ont changé de type sexuel sur le nombre total de colonies criblées est additionné au ratio du nombre de colonies survivantes mixtes sur le nombre total de colonies criblées multiplié par le ratio du nombre de sous-clones purs sur le nombre total de sous-clones criblés. Un exemple pour l’analyse moléculaire de SL-CG6 est : 16/81 + (65/81) x (42/60) x 100 = 76 %.
Etude à HML
Quelle que soit la localisation de la matrice intacte, la survie dans les souches SL-CG6
(HMLalpha Δmat HMRa-inc) et SL-CG7 (HMLalpha MAT-alpha-inc Δhmr)) ne dépasse
pas 0,2 % à la suite de l’induction de ScHo (Figure 23). Il semblerait donc que le locus
HML ait besoin que les deux locus MAT et HMR soient présents dans la même cellule
pour qu’il puisse être réparé. L’analyse moléculaire montre que les survivants ont majoritairement été coupés et réparés avec la matrice intacte présente dans la souche,
MAT ou HMR (Tableau 7). Toutefois, lorsque la matrice est localisée à HML, deux fois
plus de cellules ont changé de type sexuel.
Souche Locus criblé Résultats de PCR des colonies survivantes Résultats de PCR des sous clones Pourcentage de changement de type sexuel SL-CG6 (HMLalpha Δmat HMRa-inc) HML 65/81 mixtes HMLalpha/a-inc 16/81 pures HMLa-inc 42/60 HMLa-inc 18/60 HMLalpha 76 % SL-CG7 (HMLalpha MATa-inc Δhmr) HML 30/43 mixtes HMLalpha/a-inc 13/43 pures HMLa-inc 13/16 HMLalpha-inc 3/16 HMLapha 87 % SL-CG4 (HMLalpha-inc Δmat HMRa) HMR 70/70 HMRa/alpha-inc 103/124 HMRa 18/124 HMRalpha-inc 3/124 HMRa/alpha-inc 15 % SL-CG5 (Δhml MAT-alpha-inc HMRa) HMR 65/65 HMRa/alpha-inc 121/131 HMRa 9/131 HMRalpha-inc 1/131 HMRa/alpha-inc 7 %
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Etude à HMR
À la suite de l’induction de ScHO, seule la souche qui porte la matrice de réparation au locus MAT survit de manière considérable contrairement à la souche qui porte la matrice intacte au locus HML (Figure 23). Ceci semble être contradictoire avec les résultats obtenus dans la souche SL0B (HMLa-inc MATalpha-inc HMRa), pour lesquels le locus HMR réparait uniquement avec le locus HML (aucun survivant réparé avec MAT comme matrice n’avait été obtenu) (Maroc et al., 2020). De plus, quel que soit la localisation de la matrice, très peu de survivants ont changé de type sexuel (Tableau 7).