Mise en évidence de la conformation ordonnée du xanthane lors de sa modification

3.3.1.3.1. Description des spectres RMN et détermination des taux d’acétate et de pyruvate 172

3.3.1.3.2. Densité de greffage des xanthanes modifiés suivant le protocole à température ambiante 175

3.3.2. Processus de modification à basse température (première étape) 179

3.3.2.1. Influence de la température sur l’efficacité du couplage peptidique 179

3.3.2.2. Densité de greffage des xanthanes modifiés suivant le protocole à basse température

lors de la première étape 181

3.4. Modification chimique du xanthane sous forme désordonnée 187

3.4.1. Choix du solvant pour le protocole de modification 187

3.4.2. Mise en évidence de la conformation désordonnée du xanthane dans le DMSO 188

3.4.3. Protocole de modification du xanthane dans le DMSO 190

3.4.3.1. Choix des conditions expérimentales lors de la modification chimique 190

3.4.3.2. Choix des étapes de purification 192

3.4.3.3. Interprétation des spectres RMN

1

H pour les xanthanes modifiés dans le DMSO 192

3.4.3.4. Densité de greffage estimée des xanthanes modifiés suivant le protocole dans le DMSO

196

3.4.3.5. Comparaison de la densité de greffage entre les protocoles de modification sous forme

ordonnée et sous forme désordonnée 198

3.5. Conclusion 200

3.1.Introduction

Ce chapitre décrit les différents protocoles de modification chimique du xanthane mis au point au

cours de ce travail afin de conférer des propriétés amphiphiles à ce polysaccharide.

Pour rappel, le xanthane existe sous deux conformations différentes en solution, suivant les

conditions opératoires : une forme ordonnée hélicoïdale, très rigide, à température ambiante et force

ionique élevée, et une conformation désordonnée flexible à haute température et/ou force ionique

très faible. Ces deux conformations ont des propriétés rhéologiques bien distinctes en solution. Deux

procédés de modification chimique distincts, chacun adapté à une conformation donnée, ont donc

été développés dans le but d’étudier l’influence de ce paramètre sur le comportement du polymère

greffé. Ainsi, la modification du xanthane sous forme ordonnée est réalisée dans l’eau, celle sous

forme désordonnée dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Dans les deux cas, la modification chimique

consiste à greffer des chaînes alkyle linéaires sur le xanthane via une réaction de couplage peptidique

entre une amine et les fonctions acide carboxylique situées sur les chaînes latérales du

polysaccharide. Comme présenté dans la partie bibliographique, la plupart des articles traitant de la

modification chimique du xanthane ciblent comme site de greffage les fonctions hydroxyle de ce

polymère. Ces dernières, très nombreuses, rendent de ce fait délicat le contrôle précis de la

régiosélectivité des réactions mises en jeu et donc des propriétés apportées. L’utilisation d’une

réaction de couplage peptidique, spécifique des fonctions acide carboxylique localisées uniquement

sur les chaînes latérales, permet de s’affranchir de ces problèmes et offre un meilleur contrôle de la

réaction.

Il est également possible de greffer des chaînons hydrophobes sur les fonctions acide

carboxylique du xanthane par une réaction d'estérification. Néanmoins, le xanthane possédant à la

fois des groupements acide et alcool, l’estérification pourrait conduire à une réticulation indésirable

des chaînes de polymère entre elles. L’usage d’une amine porteuse des chaînons hydrophobes lors de

la réaction de greffage élimine cet inconvénient. De plus, la fonction amide résultant du couplage est

capable, tout comme la fonction carboxylique initiale du polysaccharide, de former des liaisons

hydrogène, liaisons qui interviennent dans le maintien de la conformation hélicoïdale du xanthane.

Ainsi, le remplacement des fonctions acide carboxylique par des amides ne modifie pas le nombre de

liaisons hydrogène potentielles, quelle que soit la densité de greffage.

3.2.Couplage peptidique par des carbodiimides

Avant de présenter les procédés de modification chimique du xanthane, quelques rappels sur le

couplage peptidique par l’utilisation des carbodiimides sont effectués dans cette partie.

Le couplage peptidique est une réaction chimique entre une amine et un acide carboxylique

préalablement activé, pour former une liaison amide. Cette liaison est également appelée liaison

peptidique, car elle est majoritairement présente dans les protéines, biopolymères d’acides aminés

très courants dans les systèmes biologiques. Le couplage peptidique tient d’ailleurs son nom de ces

composés. En effet, historiquement, ce type de réaction a été développé pour synthétiser

chimiquement des peptides en laboratoire. De nos jours, le couplage peptidique est utilisé également

dans d’autres domaines que la synthèse peptidique, comme par exemple dans la modification

chimique de polysaccharides

1-5

ou encore la fonctionnalisation de nanoparticules

6, 7

.

Il faut savoir qu’un acide carboxylique est naturellement peu réactif, car la délocalisation des

électrons rend le carbone du carbonyle peu électrophile. De plus, le groupement OH est un mauvais

groupe partant. Ces paramètres rendent difficiles les réactions directes entre une amine et un acide.

C’est pourquoi le couplage peptidique comprend tout d’abord une étape d’activation de la fonction

acide carboxylique. Cette étape consiste à remplacer la fonction OH par un groupement X à la fois

davantage électro-attracteur et bon groupe partant, afin de rendre le carbone plus électrophile.

L’amine s’additionne ensuite sur le carbonyle, puis le groupement X est éliminé :

Figure 3-1: Mécanisme de réaction d’un couplage peptidique.

Le groupe partant X provient d’une ou plusieurs espèces chimiques qualifiées d’agents de

couplage, comme des carbodiimides, des acylazoles, des sels de phosphonium ou d’uronium

8

. Dans le

cadre de notre étude, nous avons utilisé la chimie des carbodiimides pour activer les fonctions acide.

En effet, les carbodiimides sont l’une des catégories d’agents de couplage les plus étudiées et

utilisées en synthèse peptidique. Leur succès s’explique par leur grande réactivité (notamment à base

température), leur disponibilité commerciale (grande variété de substrats, ce qui implique

notamment un large choix de solvants pour les réactions) et leur prix peu élevé par rapport à d’autres

réactifs appartenant à la même catégorie. Les différentes voies d’accès aux fonctions amide via un

Figure 3-2 : Voies d’accès aux fonctions amides via un couplage peptidique avec un carbodiimide (d’après

El-Faham et al.

8

).

L’addition de l’acide carboxylique sur le carbodiimide entraîne la formation d’une O-acylisourée.

Cette espèce, très réactive, peut réagir directement avec l’amine pour donner l’amide désiré (voie A).

D’autre voies d’accès, indirectes, sont également possibles. Ainsi, en présence d’un excès d’acide, l’O

-acylisourée forme un intermédiaire anhydride (voie B). Ce dernier est ensuite attaqué par l’amine

pour aboutir à l’amide voulu. L’O-acylisourée peut également se cycliser, et former une oxalozone, qui

réagit par la suite avec l’amine (voie C). Ce réarrangement n'est toutefois possible qu'au sein d'une

molécule présentant deux fonctions amide liées consécutivement. Dans tous les cas, ces réactions

entraînent la libération de dérivés d’urée. Certains de ces dérivés peuvent s’avérer très difficiles à

éliminer. Par exemple, la N,N’-dicyclohexylurée, obtenue par réaction du dicyclohexylcarbodiimide

+

R₃N C N R₂ R₃ NH C O N R₂ O R1 Carbodiimide O-acylisourée ^O R₁ OX HOX N O R1 R O Oxazolone R1 O O O R1 Anhydride A B C C NH R1 ^O R4 Amide E D NH R₃ C O N R₂ O R1 R1 COOH R1COOH R4 NH2 R4 NH2 R4 NH2 R4 NH2 Dérivé d'urée Dérivé d'urée Dérivé d'urée HOX N-acylurée NH NH O R₃ R₂ NH NH O R₃ R₂ NH NH O R₃ R₂

(DCC, R

2

= R

3

= cyclohexyle) sur un acide carboxylique, est partiellement soluble dans tous les

solvants, sauf l’acide trifluoroacétique, ce qui complique fortement les étapes de purification

8

. Pour

pallier à cette difficulté, plusieurs agents de couplage dérivés du DCC, mais solubles dans une large

gamme de solvants (ainsi que leurs dérivés urées), ont été mis au point. Parmi ces réactifs, le

1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDAC) est très majoritairement employé en synthèse

peptidique, car ce composé et son urée sont solubles dans l’eau, et, par conséquent, faciles à éliminer

en fin de couplage.

Comme indiqué précédemment, les O-acylisourées sont des espèces chimiques très réactives et

instables. En particulier, elles s’hydrolysent très rapidement dans l’eau pour donner un acide

carboxylique : la constante de vitesse d’hydrolyse

9

, à pH = 4,75, est comprise entre 2 et 3 s

-1

. Ce

phénomène est beaucoup plus rapide que l’addition de l’amine sur le site actif. L’acide obtenu peut

néanmoins réagir de nouveau avec un carbodiimide pour recréer une O-acylisourée. Par conséquent,

ces cycles d’activation/désactivation de l’acide ralentissent la cinétique d’amidation (et consomment

le carbodiimide). De plus, l’O-acylisourée est le siège d’un réarrangement, comme indiqué sur la

figure 3-2 (voie D). Cette réaction parasite est moins rapide que l’hydrolyse et que la réaction

d’amidation

9

. Elle est cependant irréversible, et présente aussi l’inconvénient de former une N

-acylurée

10

, qui est inerte chimiquement. La réaction entre l’amine et l’acide devient alors impossible.

Ces deux processus diminuent fortement l’efficacité du couplage peptidique.

Une méthode pour augmenter l’efficacité du couplage est de transformer l’O-acylisourée en un

ester activé (voie E). Ce type de composé présente l’avantage d’être plus stable que l’O-acylisourée.

En effet, il se caractérise par une cinétique d’hydrolyse beaucoup plus lente

11, 12

(de l’ordre de l’heure

et non plus de la seconde). La stabilité accrue des sites actifs favorise donc la réaction avec l’amine.

De plus, cette fonctionnalisation offre aussi l’avantage d’empêcher le réarrangement indésirable de

activés sont 10 à 20 fois plus efficaces que leurs analogues utilisant uniquement des carbodiimides

13-16

. Nous avons donc choisi cette stratégie pour modifier chimiquement le xanthane.

L’obtention d’un ester activé est possible par l’ajout, en même temps que le carbodiimide, d’un

dérivé hydroxyle, noté HOX. Ce dérivé est qualifié de co-agent de couplage. Le mécanisme

réactionnel est décrit ci-dessous avec le N-hydroxysuccinimide (NHS) comme dérivé HOX :

Figure 3-3 : Mécanisme du couplage peptidique via un ester activé.

L’étape 1 consiste en la synthèse de l’ester activé. Ce dernier s’obtient en deux phases : formation

de l’O-acylisourée par réaction entre la fonction acide et le carbodiimide (étape 1a), puis addition de

HOX sur la fonction carbonyle, ce qui entraîne l’élimination d’un dérivé urée (étape 1b). L’étape 2 est

la réaction d’amidation, avec formation de la liaison peptidique suite à l’attaque nucléophile de

l’amine, via l’azote, sur le carbonyle (avec élimination de HOX). L’amine peut être ajoutée au milieu

réactionnel avec les agents de couplage

7, 17, 18

ou en différé

3, 4, 14

. Comme pour les carbodiimides, il

similaires à celle du phénol ou de l’hydroxylamine. Par ailleurs, certains de ces co-agents sont

solubles dans l’eau, comme le N-hydroxysuccinimide.

Comme mentionné précédemment, le couplage peptidique par les carbodiimides, avec ou sans

ester activé, est couramment employé. Néanmoins, même si le mécanisme réactionnel est bien

compris, le choix des conditions opératoires optimales pour ce type de réaction reste sujet à

controverse. En effet, la littérature comprend de nombreux exemples de couplages avec les

carbodiimides, qui se caractérisent par une très grande variété de critères expérimentaux (choix des

substrats, du solvant, des réactifs, des concentrations, de la température, etc.)

1, 2, 4, 7, 12, 14-16, 19-23

. Par

conséquent, il est difficile d’identifier avec précision tous les paramètres clefs qui régissent l’efficacité

du couplage. A ce jour, les paramètres identifiés sont le solvant

24, 25

, la température

14, 16, 20

, la

concentration des réactifs

1, 7, 13, 14, 20, 26, 27

et, dans le cas d’une réaction dans l’eau, le pH

14, 16, 20, 26

.

Le choix du solvant conditionne celui des agents de couplage à utiliser. Par exemple, en milieu

aqueux, l’EDAC et le NHS sont très majoritairement employés, alors que le DCC, non soluble dans

l’eau, et l’hydroxybenzotriazole (HOBt) comme co-agent sont très courants pour des couplages en

milieu organique. De plus, la nature du solvant impacte également le mécanisme réactionnel, et par

conséquent l’efficacité du couplage. En effet, la formation de la N-acylurée, inerte chimiquement, est

favorisée en milieu polaire

24, 25

. L’ajout de co-agents de couplage permet de limiter, voire d’éliminer, ce

phénomène.

L’efficacité du couplage peptidique avec les carbodiimides varie avec la température. La réaction

d’amidation est plus rapide à haute qu’à basse température

11, 19

. Cependant, en présence d’eau, une

température élevée favorise également la cinétique d’hydrolyse de l’acide activé

11

. En règle générale,

température augmente

14, 16, 20, 26

. C’est pourquoi, le plus souvent, le couplage en milieu aqueux est

effectué à 4°C ou à température ambiante. Certains auteurs

4, 18, 21

parviennent cependant à réaliser

cette réaction dans l’eau à des températures supérieures. Bejenariu et al.

4

, en particulier, remarquent

que la réaction de réticulation du xanthane avec l’hexanedihydrazide est plus efficace à 90°C qu’à

25°C. Ils attribuent ce phénomène à une diminution de la viscosité du milieu pour T > Tm, du fait de la

transition conformationnelle, ce qui facilite l’accès des agents de couplage et de l’hexanedihydrazide

aux fonctions carboxyliques. Dans tous ces exemples néanmoins, l’amine est introduite en même

temps que les agents de couplage dans le milieu réactionnel, ce qui favorise son addition sur l’acide

activé avant hydrolyse de ce dernier.

De nombreuses études mettent en avant l’impact de la concentration des réactifs sur l’efficacité

du couplage. Cependant, ces mêmes études ont été réalisées sur divers substrats et avec des

concentrations en agents de couplage et/ou amines très variables, ce qui rend la comparaison des

données délicate. Par exemple, le ratio ⁿ

^carbodiimide

n

_COOH

^{(avec n}

^carbodiimide

^{nombre de moles de}

carbodiimide et n

COOH

celui d’acide carboxylique) peut varier de 0,2

20

à plus de 10

13, 22, 26

, et le ratio

n

_co−agent

n

_carbodiimide

^{de 0,05 à 20}

^{13, 14, 26}

^{. On peut néanmoins remarquer certaines tendances générales. En}

premier lieu, l’évolution du rendement selon la concentration des réactifs n’est pas toujours linéaire,

et varie d’un système à l’autre. Ainsi, il a été observé que l’efficacité de la réaction diminue lorsque le

carbodiimide est introduit en large excès par rapport aux fonctions acide carboxylique

7, 20, 26

:

l’activation d’un trop grand nombre de fonctions acide favorise la formation de la N-acylurée, inerte

chimiquement

24, 28

. Comme vu auparavant, pour limiter ce problème, un co-agent de couplage est

ajouté au milieu afin de former un ester activé. Le plus souvent, l’efficacité du couplage augmente

optimal lorsque le ratio ⁿ

^co−agent

n

_carbodiimide

^{est supérieur ou égal à 1, soit dans des conditions pour}

lesquelles l’O-acylisourée est censée être totalement convertie en ester activé. Des résultats inverses

existent cependant dans la littérature, sans qu’il soit possible d’expliquer cette divergence. Sehgal et

al.

26

, par exemple remarquent que le rendement de la réaction est optimal pour

n

_co−agent

n

carbodiimide

=0,07 , puis diminue avec la hausse du ratio. Dulong et al.

1

parviennent au même

constat, pour un ratio optimal ⁿ

^co−agent

n

_carbodiimide

^{=0,04 .}

Une autre façon de limiter la formation de la N-acylurée est d’augmenter la quantité d’amine

dans le milieu. Cette méthode implique toutefois que l’amine soit ajoutée en même temps que les

agents de couplage. Dulong et al.

27

, Sehgal et al.

26

et Madison et al.

14

constatent ainsi que la densité

de greffage ou la conversion évoluent linéairement avec le ratio ⁿ

^amine

n

carbodiimide

, mais jusqu’à une

valeur critique, qui diffère fortement d’un auteur à l’autre. Au-delà de cette valeur critique, la densité

de greffage/conversion reste stable, voire diminue. Au final, malgré les quelques tendances globales

notées, il ressort de la comparaison des données bibliographiques que le choix des conditions

optimales de concentration des réactifs pour le couplage dépend fortement du système acide/amine

étudié, et doit être traité au cas par cas.

Enfin, en milieu aqueux, le couplage dépend également du pH. En effet, la réaction entre le

carbodiimide et l’acide carboxylique est optimale lorsque le pH est compris entre 4,5 et 4,75

17, 27, 29

. Le

pH acide entraîne la protonation de l’un des deux azotes du carbodiimide, comme indiqué à l’étape

1a de la figure 3-3. Ce phénomène rend le carbone situé entre les deux azotes plus électrophile et

favorise l’attaque de la fonction hydroxyle située sur l’acide. Globalement, l’étape 1 est donc

avantagée à pH acide. Néanmoins, de telles conditions de pH peuvent être défavorables pour l’étape

2, en particulier quand les amines sont constituées de chaînes carbonées sans groupement

électro-attracteur. En effet, ces amines possèdent des valeurs de pKa qui varient entre 10 et 11. Par

conséquent, elles se trouvent sous forme d’ammonium à pH acide, et réagissent très peu avec l’ester

activé. Les deux étapes du couplage présentent donc des pH optimum qui s’avèrent difficilement

compatibles, ce qui est particulièrement problématique lorsque tous les réactifs sont introduits en

même temps dans le milieu.

Pour contourner cette difficulté, certains auteurs

4, 14, 27

utilisent des dérivés aminés de faible pKa,

de façon à exécuter l’ensemble du couplage à pH acide. Dulong et al.

27

et Bejenariu et al.

4

emploient

ainsi l’hexanedihydrazide (pKa compris entre 4 et 5) pour réticuler respectivement le pullulan à pH =

4,6 et le xanthane à pH = 3. A l’inverse, Bartczak et al.

7

effectuent le couplage d’un peptide sur des

nanoparticules d’or porteuses de groupements acide à un pH égal à 9, soit proche du pKa de l’amine à

greffer. Néanmoins, plusieurs études

14, 20, 26

soulignent que l’efficacité de la réaction diminue lorsque le

pH du milieu réactionnel est trop basique : le pH trop élevé augmente la cinétique d’hydrolyse de l’O

-acylisourée

30

et de l’ester activé

11

. C’est pourquoi la majorité des couplages réalisés en une seule

étape s’effectuent à un pH intermédiaire entre le pKa du carbodiimide et celui de l’amine

7, 18, 21, 23, 26, 31,

32

. En règle générale, la gamme de pH retenue varie entre 5,5

18, 23, 32

et 8

21, 31

.

Une autre méthode consiste à faire varier le pH entre les deux étapes. Les agents de couplage

sont d’abord introduits dans le milieu acide, puis le pH est ajusté pour devenir basique et l’amine est

ajoutée (la situation inverse est aussi envisageable). Lewis et al.

16

ont testé cette technique pour le

couplage peptidique, via un ester activé, d’un anticorps humain, cT84.66, sur l’acide

1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (ou DOTA), un agent chélatant. Ils observent ainsi que

la densité de greffage maximale est obtenue quand le pH de la première étape est de 5,5, et celui de

(dichlorhydrate de N-(1-naphthyl) éthylènediamine), une sonde de fluorescence, sur la

carboxyméthylcellulose, est le plus efficace quand le pH est augmenté de 4,75 à 7 entre les deux

étapes.

Pour résumer :

Le couplage peptidique via des esters activés en présence de carbodiimides permet de former

des liaisons amide par un procédé bien connu de la littérature. Ce dernier fait appel à des réactifs

commerciaux bon marché. De plus, il est applicable à des systèmes très divers (de la modification du

polymère à la fonctionnalisation de nanoparticules) et compatible avec une large gamme de solvants

(dont l’eau). Les nombreux exemples bibliographiques indiquent cependant que le choix et

l’optimisation des paramètres expérimentaux dépendent fortement du substrat acide et/ou de

l’amine à greffer. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes appuyés sur cette méthodologie

pour greffer des amines hydrophobes sur le xanthane, sous forme ordonnée ou désordonnée. Dans le

premier cas, la modification chimique est effectuée dans l’eau, dans le second, dans le DMSO, ce qui

implique, à chaque fois, de déterminer les meilleures conditions opératoires pour le trio

polymère/amine/solvant.

3.3. Modification chimique du xanthane sous forme ordonnée

Cette section décrit le processus de modification du xanthane dans l’eau, milieu dans lequel, dans

nos conditions, le polysaccharide est sous forme ordonnée. Plus spécifiquement, deux protocoles ont

été développés : le procédé de greffage à température ambiante et celui à plus basse température.

3.3.1. Processus de modification à température ambiante

3.3.1.1.Description du procédé

Comme mentionné en début de chapitre, le couplage peptidique peut être effectué en une seule

étape, à un pH défini et constant, même lorsque la différence de pKa entre le carbodiimide et l’amine

est importante. Des expériences préliminaires de couplage entre le xanthane et l’octylamine en

appliquant ce type de protocole ont été réalisées. Nous avons testé la réaction à pH = 4,5 (meilleures

conditions pour les agents de couplage), à pH = 7 (intermédiaire entre le pH optimal pour l’EDAC et le

Dans le document Synthèse et caractérisation de dérivés amphiphiles du xanthane (Page 166-183)