miR-20 inhibe la traduction des E2F

Nos résultats démontrent clairement la capacité de miR-20/miR-17 à inhiber l’expression des trois E2F activateurs. Toutefois, miR-20 semble inhiber plus efficacement l’expression d’E2F1 que les deux autres membres. Nous avons pu observer que la mutation des sites de liaison pour miR-20 augmente les niveaux d’expression du rapporteur luciférase de 7 fois pour le rapporteur E2F1 comparativement à moins de deux fois pour E2F2 et E2F3. Il est possible d’observer la même tendance au niveau des immunobuvardages de type Western de E2F1 et E2F2, puisque l’inhibition de miR-20 augmente de deux fois plus l’expression de E2F1. Ces différentes observations nous ont porté à conclure que la fonction de miR-20/miR-17 serait de diminuer principalement l’expression de E2F1 tout en contrôlant les niveaux de E2F2 et 3. La Figure 1C de l’article dans JBC présente la cartographie des différents sites de liaison pour ces miARN dans les

différents 3’UTRs des E2F. Fait étonnant, le 3’NTR de E2F2 possède 3 sites de liaison comparativement à deux pour E2F1 et un pour E2F3. Basé sur le nombre de sites, il est étonnant que miR-20 inhibe préférentiellement E2F1 et non E2F2. Bien que le troisième site de E2F2 ne soit pas présent dans le rapporteur luciférase de la Figure 2, il est possible d’observer une diminution de l’expression des E2F endogènes deux fois plus marquée pour E2F1 que pour E2F2. Afin de tenter d’expliquer cette préférence pour E2F1, il serait intéressant d’analyser les caractéristiques des différents sites de liaison de miR-20. Un résumé de l’analyse est illustré dans le tableau II et un schéma des appariements potentiels entre miR-20 et chacun des sites est illustré à la Figure 23. Comme mentionné dans l’introduction, l’élément qui semble le plus important dans la reconnaissance d’une cible par un miARN est son noyau. Les différents sites de liaisons semblent tous posséder une bonne interaction entre leur noyau et la séquence cible avec au minimum un appariement au niveau des nucléotides 2 à 8 de l’extrémité 5’ du miARN. Comme illustré à la Figure 6B de l’introduction en B, la présence de deux 7-mers permet une inhibition respectable de la cible, ce qui est observé pour E2F1 qui possède deux 7mer-m8 pour miR-20.

Figure 23. Alignement, estimé par MultiTar, des interactions possibles entre miR-20 et les sites dans les 3’NTR des différents E2F.

Tableau II. Caractéristiques des différentes interactions prédites entre miR-20 et les E2F

Toutefois, E2F2 possède un 7mer-m8 ainsi que deux autres sites ayant une interaction au niveau des nucléotides 2 à 9 du noyau de miR-20 (voir la Figure 6 pour la nomenclature des sites). Il est difficile de prédire l’impact d’un appariement au niveau du nucléotide 9. Brennecke et al. (2005) suggèrent qu’un appariement à cette position n’influence pas outre mesure le potentiel d’inhibition du miARN (Brennecke et al., 2005). En fait, le modèle de nucléation du Dr. Bartel, illustré à la Figure 4, montre que les nucléotides 9 à 11 ne sont pas dans une orientation favorable pour lier la cible due à la présence d’une structure en hélice de type A au niveau du noyau (Bartel, 2009). Ces éléments suggèrent donc qu’un appariement au neuvième nucléotide est neutre et sans conséquences. Ce n’est donc pas cette caractéristique qui peut expliquer la diminution d’inhibition dans le cas de E2F2. E2F3 semble posséder une interaction avec le noyau de miR-20 qui est optimale pour un type 8mer, caractérisée par un appariement au 8e nucléotide et la présence d’un A à la position 1. La Figure 6A de l’introduction démontre bien l’inhibition très efficace induite par ce type de liaison, qui surpasse même la présence de deux 7mers. Cette observation pourrait expliquer l’inhibition satisfaisante de E2F3, comparable à E2F2, malgré la présence d’un seul site dans son 3’NTR. L’analyse des différents types d’interaction au niveau du noyau n’est toutefois pas concluante pour expliquer pourquoi miR-20 inhibe préférentiellement E2F1.

Tous les sites semblent aussi avoir des appariements complémentaires avec l’extrémité 3’ du miARN. La Figure 6E montre bien que l’addition d’appariements efficaces dans la portion 3’ du miARN augmente le potentiel d’inhibition. En fait, la présence d’appariements supplémentaires permettrait d’inhiber la traduction à une intensité similaire à la présence de deux sites ayant un appariement exclusif au niveau du noyau. Les travaux de Brennecke et al. suggèrent que l’appariement idéal impliquerait au moins 4 nucléotides consécutifs (Brennecke et al., 2005). De plus, les observations de Grimson et al. (2007). suggèrent que l’appariement optimal serait au niveau des nucléotides 12-18 afin de ne pas interférer au niveau de l’interaction du miARN avec RISC. En tenant compte de ces deux règles, les deux premiers sites dans le 3’UTR de E2F2 ainsi que le site dans E2F3 devraient, en théorie, avoir un bon potentiel d’inhibition. Ces observations expliquent l’efficacité du site unique dans le 3’NTR de E2F3 sans toutefois donner d’explications pour E2F2.

L’accessibilité du miARN à la cible a été estimée l’aide de l’outil de repliement de structures secondaires d’ARN MFOLD. Ce programme prédit les différentes structures d’ARN possible et retient celle avec la plus faible énergie libre d’où les unités exprimées en kcal/mol (Zuker, 2003). La présence de structure défavorable à la liaison du miARN a donc été estimée en prenant en considération deux facteurs. Premièrement, l’accessibilité locale a été estimée. Kertesz et al. ont déterminé que tenir compte des 17 nucléotides en amont du site et les 13 nucléotides en aval était optimal pour calculer l’accessibilité local (Kertesz et al., 2007). Cette fenêtre permet de vérifier que la séquence cible soit bien exposée et disposé à liaison par le miARN. L’accessibilité globale des séquences cibles a aussi été calculée afin de prendre en considération l’accessibilité du site au complexe RISC qui est de taille importante. Pour ce faire, une fenêtre plus large est prise en considération soit 70 nucléotides en aval et en amont du site de liaison. Il semble exister une certaine corrélation entre les valeurs de l’accessibilité locale et globale. Fait intéressant, basé sur cette estimation, tous les sites ont une accessibilité similaire, excepté le deuxième site de E2F1

qui serait extrêmement permissif à la liaison du miARN. Cette accessibilité accrue pourrait expliquer l’observation que miR-20 inhibe plus efficacement la traduction de E2F1 que de E2F2 ou E2F3.

La proportion de AU dans les 60 nucléotides entourant le site de liaison a aussi été calculée sur la base des observations de Grimson et al. (2007) Ce critère ne semble toutefois pas significatif, puisque tous les sites possèdent approximativement la même proportion. En fait, le calcul de la proportion de AU ne semble pas très informatif par rapport à l’accessibilité du site si on observe les résultats pour le deuxième site d’E2F1. Bien que la proportion de AU soit identique aux autres sites, le calcul de l’accessibilité par la structure secondaire démontre une accessibilité nettement plus accrue pour ce site. Prendre en considération la proportion de la nature des bases ne semble donc pas nécessairement significative. Finalement, la position des sites dans les 3’NTR ne semble pas donner d’informations additionnelles. Rien dans cette analyse ne permet d’expliquer pourquoi l’inhibition de E2F2 par miR-20 n’est pas efficace malgré la présence de trois sites. La présence de sites de d’autres miARN à proximité pourrait être une hypothèse puisqu’il y aurait interférence de liaison du complexe RISC. Toutefois, une analyse à l’aide du programme de prédiction de cibles TargetScanS ne permet pas de confirmer cette hypothèse. La liaison d’aucun autre miARN connu ne semble chevaucher les sites identifiés pour miR-20 dans le 3’UTR de E2F2.