chica para aplicações bucais
ResumoArrabidaea chica Verl. (Bignoniaceae), popularmente conhecida como Crajiru, tem sido tradicionalmente usada como agente de cicatrização de feridas. Extratos padronizados desta espécie demonstraram ser capazes de promover a cicatrização de feridas causadas pelo uso de quimioterapia e radioterapia, procedimentos convencionais para o tratamento do câncer. Quarenta por cento (40%) dos pacientes tratados com quimioterápicos desenvolvem algum tipo de complicação oral, entre eles mucosite, com sintomas incluindo dor e lesões da mucosa, provocando ulcerações, o que se torna uma carga severa aos pacientes já debilitados. O objetivo deste estudo foi desenvolver uma formulação de filme mucoadesivo para uso na cavidade bucal. Os filmes foram preparados utilizando PVA (álcool poli vinílico), sendo avaliadas as características físico-químicas, propriedades mecânicas e capacidade de mucoadesão. Estudos de citotoxicidade utilizando fibroblastos HGF-1 e queratinócitos HaCat também foram realizados. A atividade antioxidante e antifúngica dos filmes foi investigada contra diversas cepas de Candida. Os resultados mostraram a presença de nanopartículas de 200 a 300nm, potencial zeta negativo (-11,13mV) apresentando PDi de 0,14, com atividade antioxidante DPPH IC50 393,37µg/mL, FRAP IC50
1,77µg/mL, superóxido IC50 104,9µg/mL; H2O2 IC50 394,8µg/mL e HOCl IC50
6,01µg/mL CIM na faixa de 60 a 120µg/mL. As concentrações menores que 62,5µg/mL de extrato de A. chica incorporadas não afetaram a viabilidade das células HGF-1 e concentração de 31,2µg/mL para as linhagens de HaCat, sendo adequado ao uso como cicatrizante bucal.
Palavras-chave: Mucosite, Arrabidaea chica, antioxidante, antifúngico, mucoadesivo.
Introdução
O gênero Arrabidaea (Bignoniaceae) ocorre na América tropical desde o sul do México até o Brasil. Está entre as plantas medicinais de interesse ao SUS (Renisus) publicado em fevereiro de 2009 (Brasil, 2009), a Arrabidaea chica, popularmente conhecida como crajiru (Chapman, Perkin, and Robinson 1927).
O objetivo da Política e do Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (Ministério da Saúde) é “Garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional” (Brasil, 2009).
O extrato etanólico de A. chica demonstrou propriedades cicatrizantes, estimulando o crescimento de fibroblastos e síntese de colágeno tanto in vitro como in vivo (Jorge, et al. 2008), e melhorando a organização do colágeno em cicatrização de tendões (Aro et al., 2013a, 2013b). Os extratos da espécie também apresentaram atividade antimicrobiana contra Enterococcus faecalis, Helicobacter pylori e Candida spp. (Barbosa et al. 2008; Höfling et al. 2010; Mafioleti et al 2013).
Estudo pré-clínico do extrato bruto padronizado de A. chica, seco por spray drying e incorporado em base semissólida favoreceu a cicatrização de ulcerações cutâneas, avaliadas em modelo experimental de cicatrização in vivo com ratos Wistar machos (Foglio, et al.2017).
Estudos de segurança com fração de A. chica avaliaram a toxicidade, mutagenicidade e genotoxicidade, e confirmou-se que a fração não apresentou potencial mutagênico ou genotóxico, inferindo que o extrato é geneticamente seguro (Gemelli et al. 2015; Mafioleti, et al. 2013).
O extrato de A. chica demonstrou uma atividade antioxidante significativa, sugerindo uma relação com o conteúdo de flavonoides presente na espécie (Siraichi et al., 2013).
As folhas da espécie são ricas em flavonoides como luteolina, apigenina, acacetina, vicenina A, scutellarina e carajuruflavona, além das 3-desoxiantocianinas, entre elas carajurona e carajurina (Barbosa et al. 2008; Chapman, Perkin, and Robinson 1927; Siraichi et al. 2013; Takemura et al.1995; Zorn et al. 2001).
A quimioterapia é útil no tratamento do câncer. Entretanto, quarenta por cento (40%) dos pacientes que usam quimioterápicos desenvolvem algum tipo de complicação bucal como resultado do tratamento. As drogas citotóxicas como (metotrexato, 5- fluorouracil, derivados de cis platina e irinotecano) destroem as células da mucosa como resultado da inibição da mitose epitelial, induzindo atrofia e propiciando o desenvolvimento de estomatite e de ulcerações espontâneas ou traumáticas. Este quadro frequentemente se manifesta entre 4 a 7 dias após o início
do tratamento quimioterápico e geralmente caracteriza-se por um eritema doloroso generalizado.
Sintomas incluindo dor, ulceração, vômitos e diarreia são uma carga severa para os pacientes. É relatado que o tratamento com quimioterápicos pode causar diarreia em até 80% dos pacientes (Andreyev et al., 2014). Esta toxicidade resulta em reduções de dose (45%), atrasos no tratamento (71%), descontinuação da terapia (3%), aumento da frequência de infecção e custos adicionais substanciais ao sistema de saúde (Andreyev et al., 2014; Lalla et al., 2014).
Neste contexto, novos fármacos de suporte capazes de minimizar os efeitos tóxicos induzidos pelo tratamento são necessários. Isto motivou nosso grupo a desenhar um estudo clínico randomizado, para avaliar a eficácia de formulação semissólida contendo extrato padronizado de A. chica no tratamento de mucosite oral em pacientes com câncer de cabeça e pescoço, em comparação com aqueles tratados com a terapia de laser de baixa intensidade (Queiroz et al., 2018). Em continuidade aos nossos estudos, concentramo-nos no desenvolvimento de outros produtos para o gerenciamento de mucosite.
Apesar da área total disponível ser limitada, a mucosa possui uma rede de vasos sanguíneos mais concentrada do que a encontrada na pele, podendo promover um rápido início de ação dos fármacos administrados, sendo de 4 a 4000 vezes mais permeável do que a pele, conforme o produto administrado (Hu et al., 2011). A distribuição de fármacos por via oral é uma forma altamente eficaz para melhorar a biodisponibilidade. Isso ocorre porque a mucosa bucal possui um rico suprimento sanguíneo que facilita a entrada direta de moléculas do fármaco na circulação sistêmica (Patel, VF. Liu, F. Brown, 2011).
As preparações bioadesivas são preferidas para o tratamento de doenças da cavidade oral porque podem aderir à mucosa, protegendo a parte afetada e retendo a droga durante o período desejado. Exemplos de doenças da cavidade oral para as quais as formas de dosagem bucal foram projetadas incluem: estomatite, candidíase oral, doença periodontal e mucosite (Smart, 1993).
Pacientes em tratamento de câncer de cabeça e pescoço recebendo radioterapia e quimioterapia favorecem a infecção da mucosa oral, comum como consequência da xerostomia resultante da destruição do tecido glandular por radiação. Entre os organismos mais preponderantes nesses pacientes estão Candida
albicans (Belazi et al., 2004). Pacientes com candidíase oral sofrem de dor oral, sentindo um efeito análogo a uma queimadura, o que interfere na qualidade de vida do indivíduo (Singh, et al.2017).
A liberação controlada de medicamentos por via oral é bem aceita pelos pacientes, pois a cavidade bucal é facilmente acessível para a automedicação. As formas de dosagem bucal permitem que a absorção do fármaco seja rapidamente retirada no caso de uma reação adversa. As formulações de uso bucal incluem comprimidos, géis, filmes e adesivos, estes últimos preferíveis em termos de flexibilidade e conforto (Colley et al., 2018; Fennema, 1996; Owens et al., 2005; Smart, 2005, 1993).
São poucas as formulações tópicas contendo produtos oriundos de plantas medicinais, comercialmente disponíveis, para serem aplicados na cavidade oral. O álcool poli vinílico (PVA) tem sido utilizado como polímero mucoadesivo, pois forma filmes flexíveis, elásticos e permeáveis ao vapor, e ao mesmo tempo apresentam uma grande compatibilidade com pigmentos e agentes umectantes (Ikeuchi-Takahashi,Y. Kobayashi, A. Onishi, 2017).
Cada terapia requer perfis distintos de penetração e retenção da droga, para otimizar o tratamento e minimizar os efeitos colaterais. Infecções superficiais, como candidíase, afetam apenas as células epiteliais mais superficiais, e os medicamentos utilizados para tratar essas infecções não precisam atravessar a barreira de permeabilidade, mas devem ser liberados na superfície do epitélio. Doenças como a displasia oral afetam as células epiteliais e as drogas para o tratamento necessitam de uma penetração constante de princípios ativos dentro do epitélio, com a menor perda possível na superfície ou no tecido conjuntivo subjacente (Sankar et al., 2011).
Formulações contendo flavonoides podem ser úteis para tratamento de doenças bucais (Palaska et al., 2013). A aplicação de um gel mucoadesivo contendo antocianinas de framboesa preta revelou propriedades anti-inflamatórias e quimiopreventivas em lesões bucais provocadas por câncer, promovendo melhor qualidade de vida ao paciente (Mallery et al., 2008).
Observou-se o efeito das antocianinas de cascas de sementes de soja preta sobre a produção de VEGF induzida por ferida, bem como os padrões de migração celular induzida por feridas de fibroblastos e queratinócitos, sugerindo que
as antocianinas podem potencializar a cicatrização de feridas através do aumento da produção de VEGF (Nizamutdinova et al., 2009).
Em um estudo clínico com voluntários adultos jovens e saudáveis portadores de feridas ortodônticas, verificou-se que após aplicações tópicas de gel mucoadesivo contendo 10% p/p de antocianinas, houve fechamento de 73,5% do tamanho das feridas após o terceiro dia de aplicação, promovendo um melhor conforto ao voluntário (Limsitthichaikoon et al., 2018).
Vários estudos relataram que os efeitos anti-inflamatórios das antocianinas são mediados pela supressão da ativação do NF-kB (Karlsen et al., 2007) e inibição da expressão da cicloxigenase (Hou et al., 2005; Mallery et al., 2008).
Além das antocianinas, o extrato bruto de A. chica possui diversos compostos que também auxiliam na ação cicatrizante, com propriedades antimicrobiana, anti-inflamatória e anticarcinogênica, como a luteolina, apigenina e scutellareina (Jing et al. 2014; Amin et al. 2009; Lin, et al. 2008).
Em estudos de penetração cutânea in vivo das flavonas apigenina, luteolina e 7-O-β-glucosídeo de apigenina, foi observado que a apigenina e a luteolina não só foram adsorvidas na superfície da pele, mas também penetraram em camadas mais profundas (Manju and Nalini 2007; Seelinger, Merfort, and Schempp 2008)
Um dos desafios no desenvolvimento de formulações tópicas bucais é prolongar o tempo de residência da fórmula farmacêutica no sítio de aplicação (Fonseca-Santos, B. Chorilli, 2018; Patel, VF. Liu, F. Brown, 2011).
Os estudos de novas formas farmacêuticas evoluíram no desenvolvimento de novos sistemas de transporte para fitoquímicos, como transportadores fosfolipídicos, nanopartículas, micropartículas, lipossomas entre outras, que posteriormente podem ser formulados em géis, cremes e outras formas de dosagem que ajudam a aumentar a linha terapêutica de fitoquímicos, além de promover maior solubilidade e biodisponibilidade (Khan et al., 2013; Rehman and Zulfakar, 2014; Semalty et al., 2010).
O objetivo deste estudo foi desenvolver um filme mucoadesivo de PVA (álcool poli vinílico) contendo 2,5% de extrato padronizado de Arrabidaea chica para administração bucal, avaliando as propriedades físico-químicas, mecânicas, de citotoxicidade, antifúngicas e perfil de liberação in vitro.
Material e métodos
Preparo do Bioadesivo PVA método de alta energia usando sonicador de ponteira
Foi preparada solução de álcool poli vinílico de peso molecular 44.053 (PVA) a 3% por dispersão do polímero em água destilada, mantida sob agitação com aquecimento a 90°C durante 48 horas. A solução de PVA foi filtrada em funil de placa porosa.
O extrato bruto de A. chica (2,5% p/v) foi adicionado à solução de PVA sonificada em um ultrasonificador (QSonic) por um minuto, com intervalo de um minuto e o processo foi repetido por 3 vezes.
Obtenção do diâmetro médio das gotículas (φ, Z average) e índice de polidispersidade (PI)
Essa análise foi realizada no Instituto de Química – IQ/Unicamp (Prof. Dr. Nelson Duran) que gentilmente cedeu o equipamento. A determinação do diâmetro médio das partículas (φ) e do índice de polidispersão (PDi) foi realizada por Dynamics Light Scaterring (DLS) (Zetasizer Nano S, Malvern Instruments, Reino Unido). As amostras foram previamente diluídas (1:100) em água purificada. Todas as determinações foram efetuadas em triplicata, a temperatura ambiente. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (Média ± Dp).
Obtenção do potencial zeta ζ
O potencial Zeta foi determinado por espalhamento dinâmico de luz e análise da mobilidade eletroforética, medidas realizadas em equipamento Zetasizer®
300HS, a 25°C. Para a determinação, as amostras foram diluídas (1:100) em água purificada. Todas as determinações foram efetuadas em triplicado, a temperatura ambiente. Os resultados foram expressos como Média ± DP.
Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
As análises de MET foram realizadas no Centro de Imagem e Microscopia (CMI) na Faculdade de Odontologia de Piracicaba – FOP/Unicamp.
A análise da morfologia das nanopartículas foi feita por microscopia eletrônica de transmissão (MET) de acordo com o método descrito por Colaco et al. (2013), utilizando um microscópio eletrônico de transmissão (MET), marca JEOL modelo JEM 1400 (Tóquio, Japão). Uma alíquota da suspensão de nanopartículas foi
depositada em um disco de cobre, recoberta com Formvar/Carbon e seca a temperatura ambiente.
Determinação do teor total de fenólicos
O conteúdo fenólico total foi estimado de acordo com o procedimento modificado, conforme descrito (Costa et al., 2014), utilizando o reagente de Folin- Ciocalteu. Pesou-se 2,7mg do filme mucoadesivo e solubilizou-se em água, correspondendo a 1mg/ml de extrato bruto de A. chica. Realizou-se diluições seriadas na faixa de 1000µg/mL a 31,25µg/mL. Uma alíquota de 30μl desta solução diluída da amostra de teste foi transferida em placa de 96 poços, seguido por adição de 150μl de reagente de Folin-Ciocalteu, após o qual foram adicionados 120μl de carbonato de sódio à mistura reacional. A placa foi incubada durante 15min a 45°C. Utilizou-se ácido gálico como padrão e a absorbância de cada mistura reacional foi obtida em triplicata a 765nm, utilizando-se um leitor de microplacas (Synergy HT, Biotek, Vermont, EUA). Uma curva de calibração foi obtida em paralelo nas mesmas condições de operação, utilizando-se ácido gálico (5-100μg/ml R2=0,9911 ± 0,0115). O ensaio foi realizado
em triplicado e os resultados foram expressos em mg de ácido gálico equivalente por grama de peso seco (mg GAE/g extrato seco).
Determinação do teor total de flavonoides
Para a determinação do teor total de flavonoides, foi empregado o método colorimétrico de cloreto de alumínio com pequenas modificações (Costa et al., 2014). O filme mucoadesivo foi preparado de acordo com o item anterior (2.3.): 30µl de 1,0mg/mL foram misturados com 75µL de água destilada e 45µL de solução de NaNO2 a 1%. Após 5min, 45µL de solução de AlCl3 a 5% foram adicionados.
Adicionou-se NaOH e 45µL de água destilada à mistura, homogeneizou-se e mediu- se a absorbância a 510nm utilizando um leitor de microplacas (Synergy HT, Biotek, Vermont, EUA) e curva (faixa de linearidade = 5−300μg/ml, r > 0,9965 ± 0,0021) A concentração total de flavonoides foi expressa em miligramas de catequina (E) por 100 g de extrato, em duplicata, e três ensaios independentes foram realizados para cada amostra.
Atividade antioxidante in vitro
Neste teste comparou-se a atividade antioxidante do filme mucoadesivo através do teste por eliminação de radical DPPH, atividade antioxidante e poder redutor de ferro (FRAP).
Preparo da amostra
Pesou-se 2,7mg do filme mucoadesivo e solubilizou-se em água, correspondendo a 1mg/ml de extrato bruto de A. chica. Realizou-se diluições seriadas na faixa de 1000µg/mL a 31,25µg/mL.
Ensaio de eliminação de radicais livres DPPH
Este ensaio foi realizado de acordo com Costa (2014). A redução do radical DPPH foi determinada medindo-se a absorbância a 517nm. O padrão de referência Trolox foi diluído em etanol absoluto, obtendo-se uma curva de calibração (faixa de linearidade: 5-175μg/mL, R2 > 0,996). A atividade antioxidante foi calculada como uma porcentagem da descoloração do DPPH usando a equação 3:
% = [((ADPPH-AS) / ADPPH)] × 100 (Equação 3)
Onde: AS é a absorbância da solução contendo o extrato e ADPPH é a absorção da
solução de DPPH.
A concentração do extrato proporcionando 50% de atividade antioxidante (IC50) foi calculada a partir do gráfico da porcentagem antioxidante contra a concentração do extrato.
Ensaio de poder antioxidante (FRAP)
O poder redutor ou antioxidante férrico foi determinado com base no método de Benzie and Strain (1999) com pequenas modificações. A mistura reacional foi incubada a 37°C durante 30 minutos e em seguida fez-se a leitura da absorbância a 595nm. A curva de calibração foi preparada com concentrações conhecidas de sulfato ferroso 1mM (faixa de linearidade: 25–500μM, R2 > 0,998) diluído com água destilada e usado para correlacionar a absorbância da amostra e a concentração do padrão. Os resultados foram expressos em μM equivalentes de sulfato ferroso por grama de extrato seco (μM FSE/g dm).
Capacidade de eliminação de espécies reativas (EROs)
Para os seguintes ensaios, filme e padrões (quercetina e ácido gálico) foram dissolvidos em tampão fosfato e testados em diferentes concentrações. Os ensaios de eliminação de ROS foram realizados utilizando um Leitor de Microplacas Synergy HT (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, EUA) para medições de fluorescência, UV/Vis e quimiluminescência, equipado com um termostato. O IC50
correspondente a cada extrato foi obtidoa partir de três experimentos independentes, utilizando cinco a sete concentrações em duplicado, calculadas a partir das curvas de percentagem de inibição versus concentração de antioxidante. Os controles positivos quercetina e ácido gálico foram utilizados nos ensaios de eliminação do radical ânion superóxido (O2 -), peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido hipocloroso (HOCl).
Avaliação antimicrobiana preliminar
Esse ensaio foi realizado na Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP-Unicamp), no laboratório de Microbiologia sob supervisão de Simone Feira Bussato e orientação do Prof. Dr. José Francisco Hofling.
Cepas de Candida spp.
Foram utilizadas cepas padrão de referência de diversas espécies de Candida spp. obtidas da coleção Holandesa CBS, da coleção Americana ATCC e do Instituto Zimotécnico da ESALQ/USP: Candida krusei CBS 573, Candida tropicalis CBS 94, Candida guilliermondii CBS 566, Candida parapsilosis CBS 604, Candida albicans ATCC 90028, Candida glabrata IZ 07, Candida lusitaniae IZ 06 e Candida rugosa IZ12. (CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures; IZ – Instituto Zimotécnico – ESALQ/USP; ATCC- American Type Culture Collection).
Avaliação da atividade antifúngica - Concentração Inibitória Mínima (CIM)
As amostras foram testadas quanto à atividade antifúngica frente a diferentes cepas de Candida spp., de acordo com a técnica de microdiluição em caldo, seguindo a padronização descrita por Wayne (Wayne, 2008).
Foram avaliados o filme branco e o filme contendo 2,5% de extrato de A. chica. Para isso, preparou-se de cada amostra uma solução contendo quantidade equivalente a 50mg/mL de extrato de A. chica em dimetilsulfóxido (DMSO) e meio RPMI 1640, de modo que a concentração final de DMSO fosse 1%. Essas soluções foram então diluídas em meio RPMI 1640 para concentração de 1000 µg/ml.
Para preparação do inóculo, foi inicialmente transferido do estoque com glicerol mantido sob refrigeração a -20°C para caldo YPD (Yeast Peptone Dextrose), incubado por 24 horas e posteriormente transferido para placa de SDA (Sabouraud Dextrose Agar) e incubado por 24 horas a fim de reativar as cepas para uso.
Em seguida procedeu-se o ajuste do inóculo no dia do experimento: cada cepa foi diluída em solução salina (0,9% NaCl) e a turbidez foi ajustada para 0,5 escala McFarland com auxílio de leitura espectrofotométrica (absorbância entre 0,08 a 0,10) a 530nm no espectrofotômetro, correspondendo a uma concentração final de células de 2,5x104 UFC/mL.
Em uma microplaca estéril de 96 poços, foram depositados 100µl/poço do meio de cultura RPMI-1640 em toda a placa. Em seguida foram adicionadas as soluções de filme branco e filme contendo 2,5% de extrato de A. chica (560 µg/ml, 100 µl/poço, oito replicas, uma placa por amostra) na primeira coluna, a partir da qual foi feita a diluição seriada, na razão 1:2, totalizando 12 concentrações. Posteriormente, foram adicionados os inóculos das cepas de Candida spp. (100µl/poço, na razão 1:2) sendo uma cepa por linha. Foram preparadas 3 placas para cada amostra. Todas as placas foram incubadas por 48h a 37°C e aerobiose. Ao final deste período, foram adicionados 30µl/poço da solução de resazurina. Após 2 horas foi feita observação visual do desenvolvimento de cor (cor rósea, indicativo de microrganismos viáveis) e a Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi definida como a menor concentração da amostra capaz de inibir o crescimento visível da levedura (menor concentração que apresentava coloração azul).
Teste de viabilidade celular Linhagens celulares
Foram utilizadas as linhagens celulares humanas de queratinócitos imortalizados HaCat – linhagem imortalizada (CLS - Cell Lines Service, número 300493) gentilmente doadas pela Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP- Unicamp) e de fibroblastos gengivais humanos (HGF-1 ATCC® CRL- 2014™),
gentilmente doadas pelo Prof. Dr. Ramiro M. Murata da East Carolina University (ECU), de Greenville/NC. Ambas as linhagens foram cultivadas em frascos de 25cm2
com 5mL de meio RPMI 1640 (Gibco®) suplementado com 5% de soro fetal bovino
a 37ºC em atmosfera úmida com 5% CO2. Quando a monocamada celular atingiu
cerca de 80% de confluência, as linhagens foram repicadas. O desprendimento celular foi realizado mediante ação enzimática da tripsina (em solução de EDTA). Para tanto, o meio de cultura foi aspirado, o frasco lavado com 500μL de tampão de Hank’s (Sigma®) para eliminar resíduos de meio de cultura e após aspiração do tampão foram
adicionados 500μL de tripsina 2,5g/L (Vitrocell®), a 37ºC, até que as células se
soltassem totalmente. A ação da tripsina foi bloqueada pela adição de meio completo e uma alíquota dessa suspensão foi transferida aos novos frascos, completando-se o volume para 5mL.
Protocolo de viabilidade celular
No primeiro dia de experimento, as suspensões celulares foram preparadas em meio completo e ajustou-se a densidade de inoculação para 4 x 104 e
1 x 105 cel/ml, para as linhagens HaCat e HGF, respectivamente. Foram aplicados
100µl/compartimento de cada suspensão celular em placas de 96 compartimentos, que foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera 18 de 5% de CO2 e ambiente
úmido.
Alíquotas dos filmes branco e com 2,5% de A. chica foram diluídas em solução DMSO (Merck®) na concentração de 100mg/ml equivalente ao extrato de A.
chica. Para adição à cultura de células, estas soluções foram diluídas pelo menos 400 vezes em meio completo, o que evita a toxicidade do DMSO. As amostras foram adicionadas sobre as células nas placas de 96 compartimentos, com concentrações finais de 250; 125; 62,5; 31,2; 15,6; 7,8; 3,9; 1,9; 0,49 µg/mL (100µL/compartimento) em triplicata, e a seguir foram incubadas em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente
úmido. Em função do tempo de duplicação de cada linhagem, os tempos de incubação foram de 24h para HaCaT e de 48h para HGF.
A viabilidade celular foi quantificada pelo método de coloração com sulforrodamina B (SRB Sigma®). Assim, após a incubação, as células foram fixadas