1. Diffraction des rayons X
La diffraction des rayons X a été réalisée sur les échantillons (Table 3) finement broyés dans un mortier en agate avec de l’éthanol à 100 %. Les mesures ont été réalisées sur un diffractomètre Panalytical Xpert à anode de cobalt équipé d’un monochromateur, en configuration Bragg Brentano.
2. Imagerie plein champ, à épifluorescence et confocale
Les échantillons ont été observés avec un microscope droit Zeiss Axioplan 2 à épifluorescence ainsi qu’avec un microscope droit Leica DM6000B LT à épifluorescence
ont été réalisées en collaboration avec Emmanuelle Gérard (GAP-IPGP) sur un microscope confocal à balayage laser FluoViewTM FV1000 (Olympus). Celui-ci est équipé d’une diode laser (405 nm), d’un laser multi-argon (458 nm, 488 nm et 515 nm), d’un laser hélium-néon vert (534 nm) et d’un laser hélium-néon rouge (633 nm). Les longueurs d’ondes utilisées pour l’excitation lors de l’acquisition d’image sont 405 nm, 488 nm et 543 nm ; la fluorescence émise est collectée respectivement entre 425-475 nm, 500-530 nm et 560-660 nm. Ce microscope est également capable de faire de l’acquisition spectrale ; dans ce cas, l’échantillon est illuminé successivement par les lasers (405, 488, 536, 633) et la fluorescence émise est collectée avec des fenêtres de 10 nm avec un pas de 5 nm. On obtient ainsi un spectre d’émission avec une résolution spectrale de 5 nm.
3. Microscope électronique à balayage (SEM) et spectroscopie EDX (Energy-dispersive X-ray spectroscopy)
Avant l’observation au microscope électronique à balayage, les échantillons ont été métallisés au carbone ou avec un mélange or-palladium. Le microscope utilisé est un Zeiss Ultra 55 FEG équipé d’un détecteur InLens, d’un détecteur dédié aux électrons secondaire (SE2) et d’un détecteur dédié aux électrons retro-diffusés (AsB). Pour l’imagerie les électrons sont typiquement accélérés à 10 kV, on choisit un diaphragme de 30 m et une distance de travail comprise entre 2 et 7 mm. Le microscope est également équipé d’un détecteur EDX QUANTAX (X-ray Energy dispersive spectroscopy) permettant de réaliser des cartographies semi-quantitatives de la composition chimique élémentaire. Celles-ci ont été réalisées après calibration au cuivre avec la bibliothèque de références selon la méthode φρz. Lors des analyses EDX, le microscope opérait à 20 kV avec le diaphragme de 60 µm à une distance de travail de 7,5 mm. Le logiciel ESPRIT 1.8 a permis l’acquisition et le traitement des données EDX.
4. Couplage SEM et CLSM (Confocal laser scanning microscopy)
Les échantillons de microbialites inclus dans la LR-white ont d’abord été observés au microscope confocal puis au microscope électronique à balayage. La résine LR-white n’est pas fluorescente ; cela permet d’observer les microorganismes naturellement fluorescents ainsi que ceux marqués par les colorations (DAPI-Calcein). Après métallisation, les mêmes zones ont pu être observées au SEM. Cette approche permet en superposant les images obtenues d’avoir au même endroit une information sur les microorganismes présents et leur
répartition ainsi qu’une information sur la minéralogie et la distribution des phases minérales avec la résolution spatiale du SEM.
Le couplage SEM-CLSM s’est avéré très efficace pour mieux comprendre les relations entre microorganismes et minéraux ; son utilisation a été étendue à des cellules en culture simplement déposées sur lame de verre.
5. Préparation d’échantillons par FIB (Focused Ion Beam)
Des lames FIB qui sont des sections ultra-fines (~100 nm d’épaisseur) prélevées dans un échantillon ont été préparées avec un microscope dual FIB-NEON 40EsB. Cette étape a été réalisée grâce au support technique d’Imène Estève (IMPMC-UPMC). Le microscope permet d’imager la zone à couper grâce à la fonction microscope électronique à balayage, de creuser grâce au faisceau d’ion Ga+
focalisé sur la zone et d’extraire la lame excavée par micromanipulation in situ. Pour plus de détails voir Heaney et al. (2001). Le canon ionique opère à 30 kV et ~5 nA au départ pour creuser, puis l’intensité a été réduite à 100 pA lors de la phase d’amincissement de la lame. Les lames FIB produites font environ 15 µm de long, 6 µm de profondeur et 100-200 nm d’épaisseur ; elles sont ainsi transparentes aux électrons au TEM.
6. Microscope électronique à transmission et diffraction électronique (SAED)
La microscopie électronique en transmission a été réalisée sur un microscope JEOL2100F équipé d’un canon à émission de champ accélérant les électrons à 200 kV et d’une pièce polaire haute résolution (UHR). L’acquisition des images est assurée par une caméra CCD US4000 GATAN. La diffraction électronique avec sélection d’aire (SAED) a été faite avec le plus petit diaphragme c'est-à-dire sur une surface de 100 x 100 nm2.
7. Spectro-microscopie d’absorption des rayons X, STXM (Scanning transmission X-ray microscopy)
La spectro-microscopie d’absorption des rayons X a été réalisée sur les lignes STXM 11.0.2.2 et 5.3.2.2 du synchrotron ALS (Advanced Light Source, Berkeley, USA). Les acquisitions ont été réalisées aux seuils K du carbone, de l’oxygène et de l’azote et aux seuils L2,3 du calcium suivant la procédure décrite par Bluhm et al. (2006). L’anneau de stockage de l’ALS fonctionne à 1,9 GeV à un courant de 500 mA. La calibration pour le seuil K du carbone a été
c’est le pic L3 de la calcite à 349.3 eV qui a permis la calibration (Rieger et al. 1986). Les données STXM permettent d’obtenir des informations sur l’environnement atomique local (spéciation) de l’élément considéré avec une bonne résolution spectrale (0,1 eV) tout en conservant l’information spatiale sur la distribution de ces groupements (résolution spatiale minimale de 25 nm). Les données sont traitées grâce au logiciel aXis2000. Par exemple au seuil K du carbone, on peut distinguer les groupements carbonates et les différents groupements associés à la matière organique et les cartographier finement. Des exemples de données STXM en science de la Terre sont disponibles (Benzerara et al. 2004; Benzerara et
al. 2006 et Obst et al. 2009; Bernard et al. 2010).
C. Suivi de la chimie des aquariums
La chimie de l’eau des aquariums a été suivie par mesures régulières du pH et de la température. L’eau a de plus été prélevée environ tous les deux mois et a été analysée par le Service d’Analyse des Roches et des Minéraux (SARM) à Nancy. La concentration en ions majeurs a été obtenue par ICP OES (Inductively coupled plasma optical emission
spectrometry) sur Icap 6500 Thermo Scientific ; la concentration des ions mineurs à été
mesurée par ICP MS (Inductively coupled plasma mass spectrometry) sur Elan 6000 Perkin Elmer. Les échantillons ont été préparés suivant la méthode exposée dans l’article suivant :
CHAPITRE 1
Description générale des microbialites d’Alchichica :
minéralogie et diversité microbienne
« Il y a bien un domaine de la connaissance du physique et un domaine de la connaissance du vivant; mais il n'y a pas de la même façon un domaine réel du physique et un domaine réel du vivant, séparés par une certaine frontière également réelle; c'est selon les structures et les fonctions que le physique et le vital sont distincts, sans êtres séparés selon le réel substantiel. [...] vie et matière non vivante peuvent en un certain sens être traitées comme deux vitesses d'évolution du réel. »
Gilbert Simondon, L’individu et sa genèse physico- biologique p279. Ed. Jérôme Millon 1995
Cette première partie a pour but de présenter le système d’étude que sont les microbialites du lac d’Alchichica. Ceci constitue le cadre nécessaire à l’étude ultérieure des relations potentielles entre minéraux et microorganismes.
Dans un premier temps je décrirai donc la minéralogie globale du système, puis le corps de cette partie sera consacré à la description et à l’analyse de la diversité microbienne qui a fait l’objet d’une publication dans le journal PLoS ONE (Chapitre I, III, Manuscrit 1).