Nous nous attachons ici principalement à décrire le contexte actuel de l’endomicroscopie, c’est-à-dire de la microscopie optique couplée à un endoscope, qui est la cible des développements que nous allons présenter.
Un certain nombre des techniques de microscopie optique décrites au chapitre 1 ont fait récemment l’objet de travaux d’adaptation à l’imagerie endoscopique, à visée de diagnostic in- situ. Les contraintes techniques des principales méthodes de microscopie du vivant diffèrent sensiblement de celles de l’imagerie conventionnelle utilisée en endoscopie, nécessitant généralement une reconception en profondeur de certains sous-ensembles. En particulier :
La meilleure résolution impose des contraintes supplémentaires sur la qualité du
système optique de relais d’image (utilisation d’ouverture numériques plus
importantes susceptibles de générer des aberrations).
Pour la plupart de ces méthodes, l’obtention d’une image tomographie est basée soit sur un balayage point par point du plan d’intérêt (microscopie confocale, microscopie biphotonique, OCT), soit sur l’utilisation de plusieurs images
acquises séquentiellement (OCT Plein Champ). Ces approches imposent des
contraintes de vitesse, de manière à limiter la sensibilité aux mouvements (mouvements de l’opérateur et/ou du corps humain). Cette sensibilité s’avère d’ailleurs d’autant plus importante que la résolution est élevée, tout mouvement de l’objet faisant très rapidement perdre la netteté de l’image obtenue.
Enfin la haute résolution impose une limitation quant à la taille maximale du
champ imagé, très significativement inférieur à celui d’un endoscope
conventionnel. Cet aspect rend plus difficile la lecture des images et le diagnostic associé par manque d’informations de contexte tissulaire.
Endomicroscopie confocale : la microscopie confocale est la première des méthodes de sectionnement optique à avoir fait l’objet de développement visant à une adaptation endoscopique. Du fait de la géométrie d’acquisition par balayage, l’ensemble de ces développements est basé sur une utilisation limitée d’optique (principalement l’optique d’imagerie distale) et sur l’usage de fibres à la fois pour l’illumination et le transport d’images. Ainsi plusieurs méthodes de miniaturisation ont été proposées, utilisant le balayage proximal d’un bundle de fibres pour à la fois éclairer l’échantillon et transporter l’image vers le détecteur [80], utilisant un microscope confocal miniature à balayage par MEMS à la partie distale d’une fibre [81], ou bien utilisant une variante confocale par encodage spectral à l’extrémité d’une fibre [82]. Ces systèmes sont donc des endoscopes flexibles, et proposent de très bonnes résolutions – sensiblement équivalentes à celles de la microscopie confocale – typiquement de l’ordre de 1µm en transverse et de quelques micromètres en axial. Les profondeurs d’imagerie sont cependant généralement limitées à une centaine de micromètres, pour les mêmes raisons que la microscopie confocale conventionnelle. Comme pour la microscopie confocale, ces systèmes sont généralement basés sur l’usage de marqueurs fluorescents (validés pour un usage cliniques) tels que l’acriflavine ou la fluoresceine, permettant de rehausser le contraste, mais limitant la palette de structures visibles du fait de l’absence de spécificité de ces marqueurs. Le champ d’imagerie typique varie d’un diamètre de 200 à 500µm, pouvant être étendu par recalage d’images décalées suite aux mouvements de la sonde [83].
Cette technologie est aujourd’hui la plus mature, plusieurs systèmes commerciaux (CellVizio - Mauna Kea Technologies, OptiScan Five 1 – Optiscan) sont aujourd’hui utilisés à la fois en recherche sur le petit animal [ref] et en clinique sur des applications telles que les voies respiratoires [84], les voies digestives [85], ou le conduit biliaire [86].
Figure 67 : images d’endomicroscopie confocale du colon. A gauche : colon sain (cryptes), à droite : adénocarcinome. Champ d’imagerie : 200µm, résolution transverse 1µm. D’après [d’après 87]
Endomicroscopie à 2 photons : Quelques développements ont montré la faisabilité d’un système d’endomicroscopie basé sur la fluorescence à 2 photons. Ces systèmes rapportent, comme pour la microscopie de fluorescence à 2 photons, une profondeur d’imagerie plus importante que le confocal, pouvant atteindre 500µm, pour des diamètres de sonde de l’ordre de 1mm. Là encore on trouve plusieurs approches d’intégration, par utilisation de lentilles GRIN pour des sondes rigides [88-89], ou par utilisation de système de balayage distal miniaturisé en bout de fibre d’éclairage dans le cas de sondes flexibles [90].
Figure 68 : images de microendoscopie à 2 photons à sonde rigide de cerveau de souris, en différentes zone de l’hippocampe. A,B : dendrites ; C-E : neurones ; F : dendrite large. Barres d’échelle : 10µm. résolution transverse : 0,5µm ; profondeur d’imagerie 130µm. Temps d’acquisition typique pour 1 image : 0,5s. D’après [88]
Endomicroscopie par OCT : Nous avons vu que la grande majorité des dispositifs d’OCT à balayage utilisent des composants fibrés permettant de miniaturiser le système et de déporter la tête de mesure. L’adaptation endoscopique de la méthode apparaît donc naturelle, et les premiers développements ont été effectués peu après la démonstration de l’OCT [91].
La grande majorité des dispositifs d’endomicroscopie par OCT consistent à acquérir un profil radial par visée latérale et rotation d’un miroir ou prisme au niveau de la partie distale, puis à déplacer la sonde à vitesse constante, en général par retrait (« Pullback ») de manière à obtenir
un volume 3D [94]. Cette approche est particulièrement pertinente pour l’imagerie de conduits naturels tels que les artères [92] ou l’œsophage [93]. L’utilisation d’une seule fibre permet de réaliser des sondes très fines, de l’ordre de 1mm de diamètre, et les résolutions obtenues sont typiquement de 10µm en transverse et de 20µm en axial. Cette technologie est maintenant mature, et plusieurs dispositifs commerciaux sont disponibles pour des applications intravasculaires (LightLab Imaging) ou des voies digestives (Nine Point Medical).
Figure 69 : images OCT endoscopique en artériologie. En haut : visualisation radiale mettant en évidence la présence d’une plaque d’athérome. En bas : coupe longitudinale calculée à partir d’un volume acquis par retrait progressive de la sonde. D’après [94]
Ces approches d’endomicroscopie présentent un certain nombre de limitations que l’OCT Plein Champ peut prétendre combler : les approches basées sur un balayage (OCT, Microscopie à 2 photons) utilisent la plupart du temps un élément mobile miniature à l’extrémité de la sonde, rendant l’intégration complexe et nécessitant l’apport d’énergie électrique en bout de fibre. L’endomicroscopie confocale contourne le problème en déportant le balayage au niveau proximal, et en effectuant un relais d’image par l’intermédiaire d’un faisceau de fibre. Cette méthode est cependant aujourd’hui pénalisée par la nécessité d’employer des marqueurs fluorescents, dont le nombre est très limité pour un usage clinique in-vivo, qui ont une spécificité faible et qui présentent un risque pour le patient. Nous nous proposons donc d’adapter la technique d’OCT Plein Champ à l’imagerie endoscopique : la méthode permet d’obtenir de meilleures résolutions, la géométrie d’acquisition en parallèle évite l’utilisation de moyens de balayage, il est ainsi possible d’envisager la réalisation d’une sonde totalement passive, enfin la méthode permet d’obtenir un champ d’imagerie sensiblement plus étendu que les autres méthodes d’endomicroscopie haute résolution (confocal, 2 photons).