1.3 Dispositif d’OCT plein champ pour l’analyse de biopsies en contexte clinique
1.3.3 Imagerie multi-échelle
Comme décrit en 1.1.2, l’examen typique d’une lame d’histologie au microscope requiert généralement la possibilité de modifier le grandissement d’imagerie, de manière à passer d’un examen macroscopique (architecture du tissu) à un examen microscopique (détails cellulaires). Ce changement s’effectue sur un microscope traditionnel par changement de l’objectif utilisé par rotation d’une tourelle. Pour répondre à ce besoin en prenant en compte les contraintes techniques liées à l’utilisation d’un interféromètre de Linnik, l’approche la plus simple consiste à acquérir une image de l’échantillon à la résolution la plus élevée, puis d’utiliser un logiciel de visualisation permettant un grandissement/rétrécissement de l’image rapide (« zoom » numérique utilisé par exemple dans des applications grand public telles que Google Maps). Il est possible de réaliser de manière instrumentale un tel changement de résolution d’imagerie (et non de visualisation uniquement), une approche hardware s’avère cependant plus compliquée. Les approches matérielles possibles ainsi qu’un développement instrumental correspondant, finalement non retenu dans le dispositif développé, est décrit en détail au Chapitre 3 (§3.2). Nous décrivons ici la solution retenue et implémentée dans le dispositif transféré en clinique.
Image macroscopique : Afin de coller au maximum au protocole d’examen d’une pièce opératoire à partir de sa réception en salle d’anatomopathologie, nous avons intégré au dispositif une fonctionnalité de prise d’image macroscopique standard (photographie). Cette image de surface permet à la fois de repérer par examen macroscopique visuel les zones suspectes, et de repérer la zone imagée en OCT Plein champ par rapport à cet examen visuel. L’implémentation de cette fonctionnalité consiste à intégrer une caméra de type webcam de bonne définition (5Mpixels) couvrant le champ d’imagerie maximal (diamètre 28mm). La résolution optique mesurée pour l’objectif installé devant ce capteur est de 25µm. La prise de cette image
macroscopique est réalisée à l’installation de l’échantillon dans le dispositif, avant la prise d’image FFOCT.
Visualisation de l’image à grandissement variable : Nous avons intégré une méthode séquentielle d’acquisition d’images selon une géométrie en mosaïque, ainsi qu’un algorithme de stitching d’images correspondant. Pour chaque profondeur d’imagerie, la définition de la taille du champ souhaitée génère une grille de position d’imagerie en mosaïque correspondante permettant de couvrir ce champ. L’acquisition des champs élémentaires FFOCT est réalisée séquentiellement, par déplacement successifs (X,Y) du centre d’un champ élémentaire selon cette géométrie à l’aide de la plateforme de microscopie intégrée au système. Le taux de recouvrement de 2 images, nécessaire au calcul de corrélation et au recalage, est fixé à 20%. L’algorithme de stitching utilisé est une optimisation d’un algorithme Open Source disponible dans le logiciel Fiji (ImageJ), basé sur des corrélations de phase séquentielles suivies d’une optimisation globale.
La Figure 29 illustre le résultat obtenu après utilisation de ce procédé de stitching. Un échantillon de grande taille (tranche épaisse de cerveau de rat, fixé dans le formol) est imagé complètement, à environ 30µm de profondeur. Une image de 16x13mm, pour laquelle chaque pixel correspond à 0,76µm est obtenue en environ 10 minutes (4 minutes de temps d’acquisition, 6 minutes de temps de stitching), auxquelles il convient d’ajouter 5 minutes de temps de préparation de l’échantillon (positionnement dans le porte-échantillon et mise en place sous le microscope) soit une quinzaine de minutes. Ce temps est à comparer à environ 30 minutes nécessaires à l’obtention d’une coupe au cryostat pour un échantillon de taille similaire. Il est ensuite aisé de manipuler cette image de manière à obtenir une vue s’ensemble (à gauche sur l’image), une vue intermédiaire (au centre) ou une vue microscopique (à droite). Ces différentes échelles d’affichage permettent de visualiser simplement différents niveaux de détails morphologique : la structure complète du cerveau avec une vue macroscopique, l’organisation des fibres nerveuses la vue intermédiaire et les détails cellulaires pour un zoom important. Cette dernière image permet en outre d’illustrer les performances d’imagerie précédemment décrites :
Du point de vue de la résolution, on distingue les fibres nerveuses (axones), de diamètre typique de 1 à 2 µm, soit de manière individuelle soit sous forme de faisceaux. Ce type d’images est aujourd’hui unique dans le domaine de l’OCT. Du point de vue du contraste, une hyper-réflectivité est obtenue pour les fibres
nerveuses (axones), alors que les corps cellulaires apparaissent très sombres (quasi absence de signal). Les axones sont entourés d’une gaine de myéline, servant à isoler et protéger les fibres. Cette gaine est principalement constituée de lipides, d’indice de réfraction élevé (n=1,44) [46] comparativement aux autres constituants tissulaires. Le contraste OCT étant représentatif des variations locales d’indices de réfraction, c’est cette gaine qui permet de révéler par contraste d’OCT la présence d’axones.
Figure 29 : images OCT Plein Champ d’un cerveau de rat fixé, à différentes échelles de visualisation. A gauche : image grand champ (16x13mm) résultat du stitching de 22x18 champs imagés élémentaires, au milieu : image de grandissement intermédiaire (4x4mm) après zoom numérique, à droite : champ élémentaire.
On observe par ailleurs sur cette figure, pour l’image macroscopique, une trame résiduelle rendant visible la géométrie d’acquisition en mosaïque. Cet effet est dû à un éclairage non parfaitement homogène au niveau d’un champ d’imagerie élémentaire : la légère cloche d’éclairage entraîne une diminution du remplissage des pixels en bord de champ (environ 20%), d’où un contraste légèrement inférieur pour cette zone (qui correspond par ailleurs à la zone de recouvrement du stitching). Même si de nombreux algorithmes permettent de corriger cet effet de l’éclairage [47], nous avons préféré optimiser l’uniformité de l’éclairage par réglage fin du Köhler : nous obtenons sur le dispositif final un éclairage homogène à 10% permettant de supprimer cet effet.
La Figure 30 présente l’interface logicielle utilisée pour l’acquisition des images. La zone (1) correspond à l’image OCT plein champ d’un champ unitaire en cours d’acquisition, la zone (2) correspond à l’image macroscopique acquise avant imagerie FFOCT. Le carré rouge présent en (2) correspond à la zone d’imagerie FFOCT en cours.
Figure 30 : capture d’écran du logiciel d’acquisition d’images FFOCT développé. 1 : zone de visualisation d’un champ FFOCT élémentaire (780x780µm) ; 2 : image macroscopique. Le carré rouge dans l’image macroscopique correspond à l’aire imagée par FFOCT. L’image présentée correspond à la jonction derme/épiderme d’une biopsie de peau.
Cette méthode d’acquisition et de visualisation d’images grand champ permet de répondre à une des contraintes initialement identifiée, à savoir un temps d’obtention d’une image grand champ compatible avec une utilisation peropératoire (<= 30 minutes). Même si cet objectif semble atteint, il est assez frustrant de constater qu’une part non négligeable de cette durée est liée au calcul de l’image finale à partir d’une mosaïque. Pour améliorer ce fonctionnement, nous avons initié une collaboration (financement obtenu- projet ADOC (financement FEDER)) avec le laboratoire de mathématiques appliquées de l’Ecole Centrale (N. Paragios). Un nouvel algorithme de stitching a été développé, basé sur une architecture de calcul parallèle, permettant son portage sur GPU et un gain très significatif en temps de calcul. Les résultats de ces développements ont été obtenus en toute fin de ces travaux de thèse. En particulier pour l’exemple de la Figure 29, il est maintenant possible de passer de 6 minutes de temps de calcul à moins de 30 secondes (sur carte graphique Nvidia Quadro 4000). Ce développement algorithmique a fait l’objet d’un dépôt de brevet, dont une licence d’exploitation a été accordée à la société LLTech.