La microscopie inversée

La microscopie est encore aujourd’hui la seule technique capable de donner des informations précises sur la diversité et la composition de la communauté phytoplanctonique même si des progrès récents ont été clairement réalisés dans le domaine de la taxonomie moléculaire appliquée à certaines classes algales (par exemple, voir les travaux de Neilan B.A. et Wilmotte A. pour les cyanobactéries, Daugbjerg N. et Fawley M.W. pour les chlorophycées, Laeners G et Dahlberg O.L. pour les dinoflagellés, Medlin L.K. pour les chrysophycées). En effet, nous pouvons toujours dire aujourd’hui qu’aucune technique n’a surpassé celle de « l’œil humain » et qu’une étude détaillée de la richesse des espèces phytoplanctoniques passe forcément par l’observation et l’analyse des échantillons par microscopie optique.

La microscopie utilisée est dite inversée car la source de lumière et le condensateur illuminent la chambre d’analyse (voir ci-dessous) par dessus et les objectifs, situés en dessous, permettent d’observer les spécimens à travers la très fine plaque de verre située au fond de la chambre et sur laquelle les organismes ont sédimenté. Cette technique de numération cellulaire est très efficace pour dénombrer le nanoplancton et elle permet de traiter de grandes quantités d’eau (jusqu’à 100 ml), c’est à dire de concentrer le phytoplancton même s’il est très pauvre.

Notre comptage du phytoplancton du lac Marne a été réalisé à partir d’échantillons d’eau brute. Les prélèvements ont été effectués à 3 profondeurs (3m, 6m et 8 m quand cela était possible) correspondant toujours à la zone euphotique (c'est-à-dire la strate de la colonne d’eau dans laquelle les algues reçoivent plus d’1% de la lumière nécessaire à leur activité photosynthétique). Les prélèvements ont été obtenus à l’aide une bouteille de type Van Dorn de 5 litres permettant d’obtenir les échantillons aux profondeurs discrètes mentionnées ci-dessus. Les échantillons d’eau ont été fixés immédiatement sur le bateau avec du lugol, un réactif iodo-ioduré qui assure la conservation du phytoplancton et alourdit les cellules, rendant ainsi leur sédimentation plus facile. Il colore également l’amidon des cellules ce qui rend leur identification plus aisée.

CHAPITRE II : Matériels et méthodes

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Le traitement de l’échantillon a débuté par une agitation modérée afin de remettre en suspension délicatement les algues et assurer leur répartition homogène dans le pilulier de prélèvement de 150 ml. Un sous-échantillon (10 ml, 25 ml ou 50 ml) a alors été versé dans un cylindre surmontant une chambre de sédimentation (Chambre Kolkitz) et laissé pendant 24 heures à l’abri de la lumière et de la chaleur (Hasle 1978). Ce laps de temps permet d’être sur que les algues, même les plus légères, vont sédimenter au fond de la cuvette (Nielsen 1933). Puis, on a glissé la partie cylindrique sur le côté de la chambre pour la remplacer par une lamelle de couverture en verre. Enfin, la lame a été déposée délicatement sur le microscope inversé (microscope ZEISS Axiovert 135) pour éviter la re-suspension des organismes. Cette technique a été développée par Utermöhl en 1958.

L’identification microscopique des organismes phytoplanctoniques, faite au grossissement 40x, et au moyen d’une caméra AxioCAM (Zeiss) permettant l’acquisition de photographies pour une analyse ultérieure si besoin via l’utilisation du logiciel AxioVision release 4.4 (Zeiss), a été faite sur plusieurs critères : la taille, la présence ou l’absence de flagelles et leur nombre, l’organisation cellulaire (filaments, colonies, individus) et le type de membrane externe (cellulosique, siliceuse, peptidoglycanique…)… Toutes les cellules ont été dénombrées le long d’un diamètre ou de deux diagonales jusqu’à atteindre un minimum de 400 cellules. La largeur de la bande d’observation était déterminée grâce à une lame micrométrique. Suite au comptage, nous avons également effectué un balayage de la lame afin de répertorier toutes les espèces non comptées, car rares.

Nous avons alors procéder au calcul du nombre de cellules par litre. Pour cela, nous devons tout d’abord connaître le rapport de comptage qui correspond au rapport entre la

surface de la chambre (530 mm²) et la surface des bandes (11,09 mm²) :

11.09 47.8⁵³⁰

Connaissant le volume d’eau sédimenté (V), le nombre d’organismes par litre (N) est égal à :

47.8 1000

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Notons que de la prise de l’échantillon jusqu’au comptage, l’eau a subi plusieurs manipulations et plusieurs sources d’erreurs potentielles existent. Il est toujours important de garder cela en mémoire, à savoir que la vision de l’écosystème est photographique et assujettit à de nombreux biais. Quelques uns peuvent être mentionnées :

Lors de la prise de l’échantillon, les organismes ne sont pas forcément répartis de manière homogène dans la colonne d’eau. De ce fait, l’erreur faite lors de la récolte de l’eau est très variable selon la répartition du phytoplancton. L’échantillonnage discret rend difficile la mesure de cette erreur.

Lors de la prise de l’échantillon, le contenu de la bouteille de prélèvement peut ne pas être complètement homogène et il se peut que certains organismes se soient agglomérés dans certaines parties du volume du container. Ayant choisi de dénombrer les unités cellulaires, qu’elles soient individualisées ou coloniales, un mauvais brassage de la bouteille, la flottaison de certaines espèces peut donc entraîner une sous estimation de certaines espèces.

Il a été décrit que les échanges thermiques entre la chambre de sédimentation et le laboratoire peuvent provoquer des courants à l’intérieur de la cuvette pendant la sédimentation. Il en résulte une distribution hétérogène des organismes au fond de la chambre et généralement, ces derniers ont tendance à se déposer en plus grand nombre à la périphérie de la cuvette (Sournia 1979)

Selon Lund et al. (1958), en comptant 400 cellules nous atteignons une précision de 10% donc il ne semble pas nécessaire d’en compter plus. Par ailleurs, le gain de précision obtenu en comptant 10000 cellules étant trop faible par rapport au travail qu’un tel comptage demande, il ne semble pas intéressant de l’entreprendre. Concrètement et comme nous l’avons dit plus haut, notre comptage a porté sur 450 cellules au minimum (avec une erreur de 9,43%) et 5400 cellules au maximum (avec une erreur de 2,72%).

Pour évaluer plus objectivement la quantité de matière vivante autotrophe présente dans le milieu et disponible pour les consommateurs primaires, l’estimation du volume a été préférée aux comptages globaux qui surestiment beaucoup les petites espèces au détriment des plus grosses (Hillebrand et al. 1999). Le biovolume a été calculé en partant des dimensions moyennes et de la forme géométrique de l’espèce considérée. Les dimensions mesurées incluaient la membrane de la cellule mais excluaient la gaine mucilagineuse qui enveloppe certaines algues (enveloppe de nature polysaccharidique) (Hillebrand et al. 1999).

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