Microscopie de fluorescence

2.3.2.1 Principe de la microscopie de fluorescence

Certaines substances, lorsqu’elles sont soumises `a un faisceau ´electromagn´etique dont

la fr´equenceνest situ´ee dans la lumi`ere visible ou l’ultraviolet, ´emettent un autre

rayonne-ment de fr´equenceν plus petite, donc moins ´energ´etique. Ces substances sont qualifi´ees de

fluorescentes si cette ´emission se situe dans le domaine de la lumi`ere visible. Cette propri´et´e

de fluorescence est due `a la pr´esence dans la structure de ces mol´ecules de groupements

chimiques appel´es chromophores, tels que benz`ene, liaisons C=O, C=C, C=S, C=N,

C=C-C=O, C=C-C=C, N=N, N=O, NO2, S=O. Sous l’impact des photons, le chromophore

passe `a un ´etat excit´e, puis revient presque instantan´ement `a son ´etat fondamental en

´emettant de la lumi`ere. Si le compos´e est illumin´e `a sa longueur d’onde d’absorption,

puis observ´e `a travers un filtre qui ne laisse passer que la lumi`ere de la longueur d’onde

d’´emission, il apparaˆıt brillant sur fond noir, permettant la d´etection d’une quantit´e tr`es

faible de mol´ecules fluorescentes.

Dans un microscope `a fluorescence (Fig. 2.10), la lumi`ere d’excitation est issue d’une

source tr`es puissante (de l’ordre de 100 Watts). Elle traverse deux jeux de filtres :

– Le premier filtre la lumi`ere avant qu’elle atteigne l’objet `a observer, il est choisi tel

qu’il ne laisse passer que les longueurs d’onde qui excitent le colorant fluorescent.

– Le second filtre la lumi`ere qui provient de l’objet, il est choisi de fa¸con `a bloquer la

lumi`ere d’excitation et `a ne laisser passer que les longueurs d’onde ´emises lorsque

l’objet devient fluorescent.

Si l’objet n’est pas naturellement fluorescent, comme c’est le cas pour les cellules

bio-logiques, il est possible d’accrocher des fluorophores `a certains sites chimiques de fixation.

Ainsi, le marquage de certaines prot´eines sp´ecifiques des cellules ou tissus par des colorants

ou prot´eines fluorescentes (Fig. 2.11), permet leur localisation pr´ecise en microscopie de

fluorescence.

Fig. 2.10: Principe du microscope `a fluorescence, avec le jeu de filtres adapt´es `a la d´etection de la

fluoresc´eine, compos´e de deux filtres d’arrˆet (1 et 3) et d’un miroir semi-r´efl´echissant (2).

Fig. 2.11: Plages de longueurs d’onde d’absorption et d’´emission de divers colorants et prot´eines

Diff´erentes techniques sont utilis´ees pour marquer les prot´eines, deux d’entre elles

uti-lis´ees au cours de cette th`ese seront d´evelopp´ees dans la partie 2.3.2 :

– Le marquage par immunofluorescence indirecte

– Le marquage par transfection

2.3.2.2 Immunofluorescence indirecte

Une technique de coloration, bas´ee sur la sp´ecificit´e antig´enique des anticorps, consiste

`a coupler les colorants fluorescents `a des mol´ecules d’anticorps, qui se fixent sp´ecifiquement

aux macromol´ecules qu’ils reconnaissent dans la cellule (vivante ou fix´ee) ou la matrice

extracellulaire. Il est possible de coupler la mol´ecule de marquage directement `a un

anti-corps utilis´e pour la reconnaissance sp´ecifique (antianti-corps primaire), cependant, le signal de

fluorescence recueilli est plus fort en utilisant un anticorps primaire non marqu´e et en le

d´etectant par un groupe d’anticorps secondaires marqu´es qui se fixent sur lui (Fig. 2.12).

Fig. 2.12: Principe de l’immunofluorescence indirecte : l’anticorps secondaire est fix´e de fa¸con covalente

`a une mol´ecule de marquage qui le rend facilement d´etectable

Cette technique de marquage a ´et´e utilis´ee au cours de cette th`ese pour marquer la

paxilline, une prot´eine intervenant dans les complexes focaux d’adh´esion des cellules. Le

protocole suivi pour fixer et marquer les cellules adh´erentes `a la paroi des microcanaux

(apr`es les paliers de flux) est le suivant :

– Les cellules sont tout d’abord fix´ees en injectant dans le microcanal une solution de

PBS contenant 3% de PFA

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pendant 10 minutes.

– Les membranes sont ensuite perm´eabilis´ees par une solution de PBS-Triton pendant

10 minutes.

– Le syst`eme est alors rinc´e au PBS, puis avec une solution de PBS contenant 0.2% de

saponine et 2% de BSA.

– Une solution d’anticorps primaire, un anticorps de souris dirig´e contre la paxilline

humaine, est introduite dans le canal pour 30 minutes d’incubation puis les cellules

sont `a nouveau rinc´ees avec une solution de PBS contenant 0.2% de saponine et 2%

de BSA.

– Le second anticorps, un anticorps de ch`evre dirig´e contre l’immunoglobuline de

sou-ris et coupl´e au TRITC

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est alors introduit dans le canal pendant 30 minutes `a

l’obscurit´e, avant un dernier rin¸cage avec la solution de PBS, 0.2% saponine, 2%

BSA.

– Le canal est rempli avec une solution d’indice de r´efraction tr`es proche de celui du

verre (DAKO), pour ´eviter la r´efraction du faisceau lumineux `a l’interface entre le

verre et le canal.

2.3.2.3 Fluorescence par transfection

A la diff´erence des marquages avec des colorants classiques (FITC, TRITC, DAPI,

etc), qui doivent ˆetre fabriqu´es en dehors de la cellule puis artificiellement introduits `a

l’int´erieur, la fluorescence par transfection consiste `a introduire dans le g´enome de la

cellule le g`ene codant pour une prot´eine fluorescente, la GFP

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(Fig. 2.13), qui sera alors

exprim´ee directement par la cellule.

Issue d’une m´eduse (Aequorea victoria), cette prot´eine est intrins`equement fluorescente.

Son g`ene peut ˆetre fusionn´ein vitroau g`ene d’une prot´eine `a ´etudier. Le g`ene recombinant

est ensuite r´eintroduit dans une cellule, qui va synth´etiser la prot´eine de fusion, alors

fluorescente, donc observable en microscopie de fluorescence. Le marquage par la GFP

montre clairement la distribution et la dynamique d’une prot´eine dans une cellule vivante.

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Tetramethyl Rhodamine Iso Thio Cyanate, ou rhodamine

Fig.2.13: Structure de la GFP : onze feuillets β forment les planches d’un tonneau, au milieu duquel est

enfoui le chromophore actif (en vert fonc´e) (Albertset al., 2002).

Afin d’observer les effets du flux sur la r´eorganisation du cytosquelette de la cellule, il

´etait important de visualiser les ´el´ements de son cytosquelette au cours des exp´eriences en

microcanaux. Deux lign´ees de cellules transfect´ees ont pour cela ´et´e utilis´ees :

– T24 actine GFP. L’actine est un des composants principaux du cytosquelette des

cellules. Elle existe sous forme de filaments : la F-actine (Filamenteuse), et sous

forme monom´erique : la G-actine (Globulaire).

– T24 α-actinine 4-GFP. L’α-actinine 4 est une prot´eine de liaison de la F-actine qui

relie les filaments d’actine en un faisceau parall`ele r´egulier.

Dans chaque cas, diff´erents clones ont ´et´e test´es pour s´electionner le plus fluorescent. Pour

l’α-actinine 4, parmi les 4 clones diff´erents que nous avons test´es, l’un ´etait faiblement `a

moyennenment fluorescent, et 3 ´etaient tr`es peu fluorescents. Sur les deux clones test´es

pour l’actine GFP, l’un donnait un signal de fluorescence ´elev´e, l’autre donnant un signal

plus faible. A la suite de ces tests, nous avons utilis´e le clone de l’α-actinine 4 et celui de

l’actine GFP ´emettant la fluorescence la plus ´elev´ee.

2.3.2.4 Microscope de fluorescence `a l’Institut Albert Bonniot

Nous avons r´ealis´e les exp´eriences de fluorescence sur la station de vid´eo-microscopie

automatis´ee de l’Institut Albert Bonniot (IAB) d´edi´ee `a l’´etude de la dynamique de

mi-gration cellulaire de longue dur´ee (Fig. 2.14) qui comprend un microscope invers´e

moto-ris´e Axiovert (Carl Zeiss) ´equip´e de 3 objectifs (×10, ×32, ×40), des anneaux de phase

correspondants, de diff´erents filtres interf´erentiels (FITC, TRITC, DAPI), d’une cam´era

CCD MicroMAX (Princeton Instruments) et du logiciel MetaMorph (Roper Scientific).

Nous avons choisi d’utiliser ce dispositif car il poss`ede une platine automatis´ee qui permet

l’enregistrement de plusieurs champs au cours d’une mˆeme exp´erience. Les observations

sont ´et´e faites avec l’objectif ×40. Une lampe au mercure sert de source lumineuse aux

exp´eriences de fluorescence. Une chambre d’incubation isol´ee et thermostat´ee permet de

maintenir le microcanal `a 37±0.5˚C. Nous avons utilis´e le logiciel d’acquisition Metamorph,

grˆace auquel plusieurs champs peuvent ˆetre enregistr´es au cours de la mˆeme exp´erience, la

platine du microscope ´etant command´ee num´eriquement par l’ordinateur. Typiquement,

lors d’une exp´erience sous flux, 4 positions sont m´emoris´ees dans le canal, puis les images

de ces champs sont prises en contraste de phase puis en fluorescence (FITC), en faisant

pour chacune 3 acquisitions enz (`az−1µm,z etz+ 1µm) car le flux peut engendrer des

fluctuations de la position de la lamelle (d’´epaisseur 170µm donc flexible). La fr´equence

d’acquisition est plus lente qu’en contraste de phase : une acquisition (2×4×3 = 24

images) toutes les 100 secondes, afin de pouvoir affiner le r´eglage de la mise au point en z

pour chacun des 4 champs.

Fig. 2.14: Microscope de fluorescence utilis´e `a l’Institut Albert Bonniot pour les observations en

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