Les cellules H9c2 ont été ensemencées en plaque 6 puits. Après traitement, les cellules sont fixées dans un tampon contenant 2% de glutaraldéhyde et 0,1M de cacodylate de sodium pendant 1h à température ambiante. Puis elles sont rincées dans un tampon contenant 0,1M de cacodylate de sodium et 0,2M de sucrose pendant 1h à température ambiante. Les échantillons sont inclus dans de la paraffine, coupés et montés sur lames. Les images ont été obtenues à la plate-forme de microscopie électronique de l’INRA (Jouy-en-Josas, France).
IV. Dosage colorimétrique de protéines
La concentration protéique des échantillons est estimée par dosage en microplaques selon le kit micro-BCA (Pierce) puis lecture de l’absorbance à 540 nm par un spectrofluorimètre (TECAN-Genios). La réaction colorimétrique est réalisée grâce à une solution qui contient de l’acide bicinchoninique et du sulfate de cuivre (II). Les échantillons à doser sont dilués au 1/20e et au 1/50e dans de l’eau ultrapure. Après ajout de 200 µL de la
solution de réaction, les échantillons sont incubés 15 min à 65°C ou 30 min à 37°C. La
réaction est mesurée par l’absorbance du complexe Cu+ final à une longueur d’onde de 540
nm. La concentration en protéines étant proportionnelle à l’absorbance, elle est déterminée par comparaison de l’absorbance des échantillons avec celle d’une gamme étalon de concentration connue réalisée à partir d’une solution de sérum albumine bovine.
V. Gel SDS-PAGE et immunodétection par Western Blot
Les protéines des cellules H9c2 sont extraites par un tampon RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,5% acide déoxycholique) complété avec un cocktail d’inhibiteurs de protéases (Roche + PMSF 0,2mM), un cocktail d’inhibiteurs de déacétylases (Santa Cruz) et un cocktail d’inhibiteurs de phosphatases (NaF 50mM, NaPPi 5mM, DTT 1mM, β-glycérophosphate 1mM, Orthovanadate 1 mM) pendant
30 min à 4°C. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation 30 minutes à 20 000g à
4°C, les protéines extraites sont dosées par le test BCA puis dénaturées par chauffage pendant 5 min à 95°C en présence de tampon dénaturant Laemmli 5X (300 mM Tris, 50% glycérol, 12,5% SDS, 50 mM DTT, 0.05% de bleu de bromophénol, pH=6,8) en utilisant 1 volume de tampon pour 4 volumes de protéines. Trente à cinquante microgrammes de protéines sont ensuite séparés par migration dans un gel d’électrophorèse SDS-PAGE (Tris-glycine) à 6- 15% d’acrylamide (selon la taille des protéines à séparer) sous l’action d’un voltage constant de 120 V. Les gels sont ensuite transférés sur une membrane de PVDF (0,45 μm, Immobilon- P, Millipore). Le transfert est réalisé dans un appareil semi-sec Biorad (TRANS-BLOT SD®) en appliquant un courant de 15-20V pendant 45-60 minutes selon la taille des protéines à transférer. L’efficacité du transfert est contrôlée par coloration des protéines au rouge
Ponceau pendant 5 min (rouge Ponceau 0,2%, TCA 0,3%). La membrane PVDF est saturée
en protéines pendant 1 heure dans une solution de TBS-Tween 0,1% additionnée de BSA à 5% (p/v). Elle est ensuite incubée soit une nuit à 4°C, soit 2h à température ambiante, en présence de l’anticorps primaire (dilué dans du TBS-Tween 0,1% + BSA 0,5%) dirigé contre la protéine d’intérêt.
Tableau 5 : Liste des anticorps utilisés
La membrane est ensuite rincée avec une solution de TBS-Tween 0,1% avant d’être incubée une heure sous agitation à température ambiante en présence de l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase. Les anticorps secondaires utilisés proviennent de chez
Jackson Immunoresearch et sont utilisés à la dilution de 1/50000e. La membrane est rincée six
fois 5 min dans une solution de TBS-tween 0,1%, puis incubée pendant 5 min en présence du substrat de la peroxydase (Millipore), avant révélation par un appareil Chemidoc XRS (Biorad) utilisant la méthode ECL selon les instructions de Millipore. Le logiciel ImageJ a été utilisé dans le but de calculer les densités relatives de chaque bande. Les intensités des bandes correspondant aux protéines d’intérêt ont été normalisées avec celles de la -actine. Les données obtenues sont exprimées sous forme du ratio de ces deux intensités.
VI. Extraction d’ARN et RT-PCR quantitative
Les ARN sont extraits à partir des H9c2 grâce au kit ZymoResearch QuickRNA MiniPrep, selon les instructions du fabricant. Un microgramme d’ARN totaux est reverse- transcrit par le kit BioRad iScript. Lors de la PCR quantitative, l’ADNc est amplifié par le supermix Ssofast Evagreen de BioRad en deux étapes : les ADNc sont chauffés à 95°C pendant 5 min, puis ils subissent 50 cycles de dénaturation (2 sec à 95°C) –
Cible de l’anticorps Dilution Fournisseur
Acétyle-histone H1 1/1000e Sigma
Acétyle-lysine 1/1000e Cell Signaling
Acétyle-p53 1/500e Abcam
ATF4 1/200e Santa Cruz
β-actine 1/20000e Santa Cruz
CHOP 1/500e Cell Signaling
eIF2α 1/1000e Cell Signaling
eIF2α-phosphorylée 1/500e Cell Signaling
GADD34 1/200e Santa Cruz
Grp78/BiP 1/250e Cell Signaling
Grp94 1/500e Cell Signaling
PERK 1/500e Cell Signaling
PERK-phosphorylée 1/500e Cell Signaling
hybridation/élongation (5 sec à 60°C). Les amorces utilisées provenant de chez Eurofins sont listées dans le tableau 6.
Tableau 6 : Séquence des amorces PCR utilisées
Les résultats sont analysés selon la méthode des « delta » de Cq, où Cq est le « cycle de quantification », cycle auquel le produit amplifié commence à être détecté. Le ratio suivant est calculé : (1+Egène cible)^-(Cqéchantillon – Cqcontrôle) gène cible / (1+Egène de référence)^-(Cqéchantillon –
Cqcontrôle) gène de référence, où E correspond à l’efficacité de la réaction de PCR. Selon ce calcul,
l’expression du contrôle est égale à 1.
Gène Espèces Amorce sens Amorce antisens
ATF3 Rats
souris ATGTCCTCTGCGCTGGAGT ACACTTGGCAGCAGCAATTT ATF4 Rats
souris AAACCTCATGGGTTCTCCAG TCTCCAACATCCAACTGTCC Calreticuline Rats
souris CTGGGTCGAATCCAAACATAA GCGTAAAATCGGGCATCTT CHOP Rats
souris TATCTCATCCCCAGGAAACG CAGGGTCAAGAGTAGTGAAGGTTT EDEM1 Rats
souris TGGGCTGGATTCCTTCTATG GGTGGGTCTCCTTCTCCTTC GADD34 Rats
souris GGACCCTGAGATTCCTCTGA GCCCAGACAGCAAGGAAAT GRP78 Rats
souris TGCAGCAGGACATCAAGTTC TTTCTTCTGGGGCAAATGTC GRP94 Rats
souris TGCTTCTGATGCTTTAGACAAGA CTGTGACATGCAGCAGGTTT INO1 Rats
souris GCTACGCGTTTCACCTTCC CCATAATAGTTTGCCTCCTTGC P58IPK Rats
souris CAGTTTCATGCTGCCGTAGA GCTTTTGATTTGCCCATAGC PDI4 Rats
souris CTGATTGGACACCTCCACCT AGGGGCAAGTTTCTTGCAG SIRT1 Rats
souris AAAAGATAATAGTTCTGACTGGAGCTG TGAAGAATGGTCTTGGGTCTTT XBP1s Rats
VII. Immunoprécipitation
Pour mesurer l’acétylation de protéines d’intérêt, nous avons utilisé une approche par immunoprécipitation (IP) en conditions dénaturantes.