Si l’immunodétection permet de visualiser un grand nombre de protéines liées à la réponse bio-logique à l’irradiation, elle ne constitue qu’une photographie à l’instant t de l’échantillon après irradiation. L’utilisation de techniques de vidéomicroscopie permet d’obtenir des données dy-namiques pour une protéine donnée, et ce quelques secondes après irradiation.
2.1. Les protéines d’intérêt
Pour caractériser l’irradiation par microfaisceau d’ions, nous avons besoin d’une réponse biolo-gique rapide. Le couplage avec la vidéomicroscopie, permet d’aller plus loin qu’avec les tech-niques d’immunodétection. Par ailleurs, afin de mettre au point nos protocoles d’irradiation et d’acquisition, il est nécessaire de disposer d’une protéine qui répond facilement à l’exposition aux rayonnements ionisants, qui est rapide, et qui peut être couplée à un fluorochrome pour la microscopie de fluorescence. Nous avons choisi la protéine XRCC1 (X-ray repair cross-complementing group 1). Elle joue un rôle central dans un grand nombre de mécanismes de ré-paration de l’ADN, comme la réré-paration par excision de base (BER), ou la réré-paration des cas-sures simple-brin de l’ADN (Brem and Hall 2005, Caldecott 2003, Mortusewicz and Leonhardt 2007).
Des cellules HeLa ont été transfectées* de manière transitoire pour exprimer cette protéine cou-plée à la GFP. XRCC1-GFP est exprimée dans le noyau cellulaire de manière uniforme (cf. Figure 20). Elle permet donc de visualiser les noyaux cellulaires et de les cibler pour l’irradiation par faisceau d’ions. Par ailleurs, son intérêt principal dans notre étude est sa capacité à venir se relo-caliser sur les sites ADN endommagés, et ce quelques secondes seulement après irradiation (Mortusewicz and Leonhardt 2007).
* La transfection consiste à introduire un ADN étranger au sein de cellules cultivées in vitro, généralement pour leur faire exprimer un gène donné. Cela peut conduire par exemple à l’expression d’une protéine couplée à un marqueur fluorescent (histone H2B-GFP, protéine XRCC1-GFP, …).
Micro-irradiation à l’échelle cellulaire et vidéomicroscopie
Cette protéine a été utilisée sur plusieurs aspects de ces travaux. Premièrement, sa capacité à se relocaliser sur les sites endommagés juste après l’irradiation permet de visualiser directement les conséquences de l’irradiation, sans avoir recours à l’immunodétection. Il est donc possible de savoir directement si le noyau cellulaire a été irradié, et la précision de tir sur cellules est direc-tement mesurable. Deuxièmement, le recrudirec-tement de cette protéine peut être visualisé par vi-déomicroscopie, permettant de mesurer la cinétique de relocalisation. La méthode de mesure mise au point en utilisant la protéine XRCC1-GFP est expliquée plus en détails dans le chapitre B-4.1.
Le groupe IPCV est également impliqué dans la modélisation de l’interaction rayonnements ioni-sants – vivant et, au travers de la collaboration Geant4-DNA (Incerti et al 2010), cherche no-tamment à caractériser les dommages ADN indirects radio-induits. Si un certain nombre de tra-vaux ont été réalisés en utilisant les UV, la caractérisation de ces dommages par micro-irradiation par faisceau d’ions est inédite. Dans ce cadre, nous avons considéré l’enzyme OGG1 (8-oxoG ADN-glycosylase), impliquée dans l’excision de la base oxydée 8-oxoG, produit majori-taire de l’oxydation de bases par des espèces réactives oxygénées créées par les rayonnements ionisants. Des cellules HeLa transfectées pour exprimer OGG1 couplée à la GFP expriment cette enzyme uniformément au sein de leur noyau. Par conséquent, ceux-ci peuvent être ciblés dans le cadre d’une micro-irradiation par faisceau d’ions. Il a été montré que OGG1 est recrutée au ni-veau des lésions ADN indirectes induites par des UVA quelques secondes après irradiation (Campalans et al 2007). Au cours de ces travaux, nous avons appliqué la méthode mise au point grâce à l’étude de XRCC1-GFP pour mesurer la cinétique de relocalisation d’OGG1-GFP après
Figure 20 : Visualisation de noyaux de cellules HeLa exprimant la protéine XRCC1-GFP avec le microscope présent sur la ligne
B–IRRADIATION D’ÉCHANTILLONS BIOLOGIQUES VIVANTS
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2.2. Protocole d’irradiation et de vidéomicroscopie
Le protocole d’irradiation des noyaux de cellules HeLa exprimant la protéine XRCC1-GFP ou OGG1-GFP se déroule en plusieurs étapes : la visualisation, la sélection des cellules à irradier, l’irradiation des cibles et la vidéomicroscopie.
2.2.1. Visualisation, sélection et ciblage
Le puits de culture contenant les cellules est placé verticalement entre la fenêtre d’extraction et les objectifs du microscope. Le contenu du puits est visualisé en fluorescence avec le microscope et rapidement exploré afin de déterminer des zones d’intérêt. Le ciblage des noyaux cellulaires d’intérêt et l’acquisition des images ont été effectués avec un objectif 63x à longue distance de travail (LD Plan-Neofluar 63x/0.75, Résolution optique d’environ 400 nm, Carl Zeiss MicroIma-ging GmbH).
Les noyaux cellulaires visibles en fluorescence et sélectionnés sont donc choisis comme cible (cf. Figure 21), et leur position est enregistrée par le programme MIA afin de venir placer le faisceau en ce point lors de l’irradiation.
2.2.2. Irradiation et vidéomicroscopie
Les noyaux ciblés ont été irradiés avec des protons ou des particules α de 3 MeV. Le nombre de particules délivrées dans les noyaux cellulaires a été contrôlé en ajustant le temps d’ouverture du faisceau. L’incertitude associée au nombre moyen de particules délivrées est √ , toute autre source d’incertitude (sur l’intensité du faisceau, le temps d’irradiation, …) étant négligée.
Figure 21 : Sélection de noyaux pour l’irradiation – exemple de noyaux exprimant XRCC1-GFP. Les noyaux sélectionnés sont marqués d’une croix rouge et leur position est enregistrée pour y
Micro-irradiation d’un organisme multicellulaire : Caenorhabditis elegans Dans le cas de la caractérisation de la précision de tir du système, les noyaux ont été irradiés selon un motif en croix de 5 points et de 10 μm de large. Dans les études de cinétique de recru-tement de XRCC1-GFP et OGG1-GFP, les noyaux ont été irradiés en un point unique.
L’irradiation est réalisée en parallèle de la vidéomicroscopie. L’irradiation a lieu 10 s après le début de l’enregistrement. Afin de limiter les effets délétères d’une exposition trop importante de la lumière utilisée pour la fluorescence (photoblanchiment, …), un compromis doit être trou-vé entre qualité des images, quantité d’informations, et intensité de la lumière. Pour cela, nous avons choisi un intervalle de 2 secondes entre chaque image, avec un temps d’exposition des images entre 150 et 300 ms.
La durée d’acquisition pour les noyaux exprimant la protéine XRCC1-GFP a été de 3 min, et pour les noyaux exprimant la protéine OGG1-GFP, de 10 à 30 minutes.