MiARN et processus fibrotique

1) Généralités

C’est en 2007 que le premier miARN dérégulé dans la fibrose a été cité (van Rooij, Sutherland et al. 2007). Les chercheurs ont montré que miR-208, un miARN exprimé spécifiquement dans les cardyomyocytes, était un médiateur de la fibrose cardiaque.

Les mécanismes de progression de la fibrose sont similaires quel que soit l’organe atteint, il est donc important de s’intéresser aux dérégulations des miARN dans différents cas pathologiques impliquant un processus de fibrose, ce qui offre une vue plus générale des différentes voies de signalisation qu’orchestrent les miARN, qui sont bien souvent complexes et encore mal comprises .

On l’aura remarqué dans le chapitre précédent, le TGF- β est la molécule clé de la fibrose pulmonaire et représente la cible thérapeutique centrale. Cependant, le TGF-β est une cytokine pléiotropique, aux multiples effets biologiques, et son blocage chronique n’est pas sans risque. En effet, l’inhibition complète du TGF- β pourrait induire comme chez la souris

Figure 22 : Rôle des protéines Smads dans la régulation de la transcription et de la maturation des miARN (D’après Blahna, 2013)

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une forte inflammation et un décès précoce (Kulkarni, Huh et al. 1993). Toutefois, il est peut être possible de contourner son inhibition complète par une compréhension approfondie des miARN impliqués dans cette voie de signalisation.

2) TGF- β et miARN : des liens complexes

De nombreux miARN ont été montrés régulés par le TGF-β, au niveau transcriptionnel mais aussi de manière plus originale au niveau de leur la biogenèse (figure 22) (Butz, Racz et al. 2012). En retour, la grande majorité des acteurs de la voie du TGF-β sont également des cibles de miARN.

3) La régulation transcriptionnelle des miARN par les protéines Smad

La régulation transcriptionnelle peut se faire de manière (i) directe en interagissant avec des promoteurs spécifiques induisant ainsi une activation ou une répression de la transcription des miARN, mais aussi de manière (ii) indirecte par l’interaction des protéines Smad avec d’autres facteurs protéiques.

(a) La répression directe de la transcription

Smad3 a été impliquée directement dans la repression de l’expression de plusieurs miARN. Des expériences de ChIP anti-Smad3 ont permis de confirmer l’interaction de Smad3 avec le promoteur de let-7, induisant ainsi sa répression lors de la fibrose pulmonaire induite par bléomycine chez la souris (Pandit, Corcoran et al. 2010). De même, l’utilisation d’un modèle de fibrose rénale induite par obstruction urétérale unilatérale de souris sauvages ou bien Smad3-/-, montre que contrairement aux souris Smad3-/- résistante à la fibrose, les souris contrôles développent une fibrose rénale associée notamment à une répression directe de la famille de miR-29 par Smad3 (Qin, Chung et al. 2011). Enfin, la stimulation de myoblastes C2C12 déficientes pour Smad3 par le TGF-β ne conduit plus à la répression de l’expression de miR-24, contrairement aux cellules C2C12 sauvages, démontrant ainsi l’implication de Smad3 dans la répression de l’expression de ce miARN (Sun, Zhang et al. 2008).

(b) Activation directe de la transcription par la voie classique

De nombreux miARN ont été montrés surexprimés suite à l’activation de la voie canonique du TGFβ, mais souvent de manière tissu-spécifique. Ainsi, un total de 28 micro- ARN sont significativement surexprimés suite à une stimulation de cellules épithéliales de glandes mammaires de souris (NMuMG) par le TGF-β. À contrario, le même traitement TGF- β sur les cellules NMuMG déficientes pour Smad4 abolit cette induction (Kong, Yang et al. 2008). Pour un de ces miARN, miR-155, une étude classique de promoteurs par l’utilisation

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d’un vecteur luciférase contenant la séquence promotrice du gène BIC, confirme que l’induction de miR-155 est dépendante de l’interaction de Smad4 avec cette région promotrice (Kong, Yang et al. 2008). Dans un autre modèle, le modèle de fibrose rénale induite par obstruction urétérale unilatérale de souris, un criblage d’expression à l’aide de microarrays et de PCR-quantitative, a révélé une induction importante de miR-192. Celle-ci est retrouvée in vitro après traitement par le TGFβ dans les cellules épithéliales rénales humaines (TEC), (Chung, Huang et al. 2010). Des expériences de ChIP anti-Smad3, suite à une stimulation TGF-β à la fois dans des cellules épithéliales rénales humaines (TEC) et des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), révèlent en effet que l’induction de miR-192 est régulée dans les deux types cellulaires par l’interaction de Smad3 avec une région SBE conservée (Smad Binding Element) dans le promoteur de miR-192 (Chung, Huang et al. 2010). Tout récemment, l’équipe de Kaminski a mis en évidence l’augmentation de l’expression d’un cluster de 24 miARN localisé sur le chromosome 14q32 dans des biopsies de poumons de patients avec une IPF. Plusieurs sites de fixation de SMAD3 ont été trouvés dans le promoteur putatif de ce cluster et en accord avec ces hypothèses, plusieurs de ces miARN, dont miR-154 est induit en réponse au TGFβ dans des fibroblastes pulmonaires (Milosevic, Pandit et al. 2012).

(c) Contrôle indirect de la transcription

En plus de l’association directe des protéines Smad3/4 avec les promoteurs de gènes codants pour des miARN, les protéines Smad peuvent moduler l’expression des miARN de manière indirecte via l’activation de voies de signalisation alternatives. C’est par exemple le cas du cluster miR-143~145, induit à la fois par le TGF-β et la protéine BMP-4 (Bone Morphogenetic Proteins) dans les cellules vasculaires du muscle lisse (Davis-Dusenbery, Chan et al. 2011). Cette régulation est liée à l’activation du facteur SRF (Serum response factor) et de la myocardine, après un traitement TGF-β, conduisant à l’activation du facteur MRTF (Myocardin related transcription factor).

(d) Régulation épigénétique des miARN

Comme tout facteur de transcription, l’activité des protéines Smads dépend du contexte épigénétique cellulaire (Kaneda, Fujita et al. 2011). Ainsi, dans un modèle de cellules MEF transfectées avec l’oncogène RasV12, les analyses de ChIP-seq et de chIP-on-chip anti Smad-1 révèlent qu’une multitude de régions promotrices, cibles de Smad-1 sont modifiées par un gain de tri-méthylation sur la lysine-4 de l’histone H3 (H3K27me3) ou une perte de tri-méthylation sur la lysine-27 de l’histone H3 (H3K4me3), induisant ainsi une

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activation ou une inhibition d’expression de miARN impliqués dans la sénescence induite par Ras (Kaneda, Fujita et al. 2011). De plus, les miARN sous contrôle de la voie du TGF-β peuvent eux même être à l’origine de modifications épigénétiques. C’est le cas de miR-29 et miR-206, impliqués dans la différenciation des cellules musculaires (Winbanks, Wang et al. 2011). En effet, le signal induit par le TGF-β est associé d’une part à une augmentation d’expression de l’histone déacetylase-4 (HDAC4) via la liaison de Smad3 sur son promoteur. D’autre part, HDAC4 est une cible de miR-29 et de miR-206. Ainsi, l’inhibition de l’expression de ces deux miARNs par le TGF-β permet de maintenir l’expression de HDAC4, et par conséquent maintenir un état différencié stable (Winbanks, Wang et al. 2011).

(e) Régulation post-transcriptionnelle

La voie de signalisation induite par le TGF-β a non seulement un impact sur la transcription des miARN mais aussi sur leur maturation (Blahna and Hata 2013).

En étudiant l’implication de miR-21 sur la répression de l’expression de PDCD4 (programmed cell death 4) dans les maladies cardiovasculaires et le cancer, l’équipe d’Akiko Hata a découvert que l’induction de la forme mature de miR-21 par le TGF-β était sous contrôle post-transcriptionnel, l’expression du pri-miR-21 restant stable (Davis, Hilyard et al. 2008). L’analyse des profils d’expression de miARN par microarray après un traitement TGFβ ou BMP sur des cellules primaires du muscle lisse d’artères pulmonaires humaines (PASMCs) révèle qu’un sous ensemble de miRNA induits possèdent cette même particularité. Ces miARN partagent une séquences consensus SBE (Smad Binding Element) : 5’-CAGAC- 3’ au niveau de la tige boucle des transcrits primaires de miARN induits (Davis, Hilyard et al. 2010). Les expériences d’immunoprécipitation d’ARN en utilisant un tag GST-Smad démontrent une interaction directe entre les protéines Smad et la séquence consensus SBE des pri-miARN. De plus, une mutation dans la séquence SBE du pri-miR-21 comparé au pri-miR- 21 contrôle, abolit sa maturation en miARN, en empêchant le recrutement des Smad au niveau de la tige boucle. Toutefois, un siARN dirigé contre Smad4 n’affecte pas la maturation de miR-21, mais est nécessaire à sa régulation transcriptionnelle (Yu, Bi et al. 2008). Un complexe Smad2/3 peut ainsi se lier directement au niveau du pri-miARN, ce qui va favoriser le recrutement de l’endonucléase Drosha et accélérer leur maturation (Davis, Hilyard et al. 2010 ; Butz, Racz et al. 2012).

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VIII) Une régulation réciproque: contrôle de la voie canonique TGF-β par les