Biogenèse et maturation des miARN

Chez les mammifères, il existe différentes voies alternatives de biogenèse des miARN, ce qui reflète une grande flexibilité en terme d’évolution et d’adaptabilité à différentes sources d’ARN double brin (Yang and Lai 2011).

(a) Voie canonique de maturation des miARN

La voie canonique de maturation des miARN se caractérise par deux clivages successifs du transcrit primaire « pri-miARN » (Figure 17). Le premier clivage est assuré par un complexe protéique appelé « microprocesseur » dont le cœur se compose d’une endonucléase de type RNase III « Drosha » (figure 18A), associée à la protéine de liaison aux ARN double brin DGCR8 « Pasha » (figure 18B), qui va permettre par son positionnement précis sur le pri-miARN de diriger le clivage de Drosha au niveau de la 11ème base à partir de la base de la structure en « tige-boucle » (Ghildiyal and Zamore 2009).

Figure 18 : Les différents acteurs impliqués dans les processus de maturation des miARN. (A) Le domaine RNase III (RIIID, en orange) est le domaine catalytique qui est responsable de la réaction endonucléolytique des enzymes RNase III comme Dicer et Drosha. Le domaine dsRBD (en bleu) est le domaine de liaison à l'ARN double brin. La fonction biologique de la région riche en proline (P- riche, en bordeaux) est inconnue. La région RS- riche (en mauve) est riche en arginine et résidus sérines, sa fonction est également inconnue. Toutefois, l’extrémité C-terminale de cette région s’avère importante pour l'activité de Drosha. Le domaine PAZ (en vert) se lie à l'extrémité 3' du miARN. Le domaine ARN hélicase (DEAD-box) est typique des enzymes qui hydrolysent l'ATP et facilite la fixation avec le duplex ARN. Le domaine DUF283 n'a pas de fonction connue. (B) Le motif WW de la protéine DGCR8 sert à l’interaction avec d’autres protéines en se liant au domaine « P- rich ». (C) Le domaine des récepteurs de transport nucléaire (NTR) se trouve dans un grand nombre de protéines de transport nucléaire tel que l’exportine 5 qui est dépendante de la petite protéine G « Ran » (D’après Narry Kim, 2005)

45

Ce complexe Drosha/Pasha peut interagir avec deux protéines de la famille des « DEAD- box helicase protein », p68 appelée aussi DDX5, ainsi que p72 (DDX17) intervenant dans la maturation de certains miARN, bien que le mécanisme exact ne soit pas encore bien caractérisé. La maturation de certains miARN nécessite la présence de p72 uniquement alors que pour d’autres elle requiert p68, suggérant une complexité structurale importante au niveau du microprocesseur (Fukuda, Yamagata et al. 2007). L’excision provoquée par le microprocesseur permet le recrutement d’exonucléases 5’-3’ et 3’-5’, entraînant la dégradation des séquences flanquantes. Ce premier clivage va générer un « pré-miARN » d’environ 70 nucléotides, et va pouvoir être exporté vers le cytoplasme par le complexe Exportine 5 (EXP5)-RanGTP (figure 18C).

C’est au niveau du cytoplasme que le second clivage a lieu, par une autre RNAse de type III; Dicer, associée avec plusieurs cofacteurs, notamment TRBP « TAR RNA Binding Protein ». Ce dernier clivage génère un duplex de miARN, dont la longueur est de 22 nucléotides environ. Le duplex est composé d’un miARN mature dit « brin guide » car il permet de guider la répression vers les ARN messagers cibles, et d’un second miARN dit brin « passager » ou encore « star », qui va être exclu du complexe RISC puis dégradé. Cependant, le brin « star » peut aussi être recruté par le complexe RISC et cela pourrait dépendre de la stabilité d’appariement du complexe au niveau 5’ : plus elle est faible thermodynamiquement, plus le brin est majoritairement incorporé (Schwarz, Hutvagner et al. 2003 ; Preall, He et al. 2006). La nouvelle nomenclature de miRbase recommande donc maintenant le terme de « 3- p » ou « 5-p » en fonction de l’extrémité du miARN au sein du pré-miARN, puisqu’on trouve pour la plupart des miARN la séquence des 2 brins dans les bases de données de séquençage.

(b) Les voies alternatives de maturation des miARN

Il existe différentes voies alternatives décrites dans la littérature qui contribuent à la maturation des miARN, parmi elles deux voies majeures :

 Maturation indépendante de Drosha/DGCR8

Le séquençage du génome de la drosophile à révélé l’existence de petites sequences d’ARN double brin qui correspondent à des séquences d’ARN introniques structuré en tige boucle nommés « mirtrons », pour lesquelles les extrémités 5’ ou 3’ du petit ARN mature coïncident avec des sites d’épissage (Okamura, Hagen et al. 2007 ; Ruby, Jan et al. 2007), ce qui ne nécessite plus l’intervention de Drosha/DGCR8. Ce type de miARN intronique a par la suite été découvert chez plusieurs espèces de vertébrés (Yang and Lai 2011).

Figure 19 : Protéines impliquées dans la répression de gènes par les miARN. (A) La protéine Ago2 est représentée comme un exemple de la famille Argonaute, elle se compose de quatres domaines : le domaine N-terminal, le domaine PAZ qui lie l’extrémité 3‘ des miARN, le domaine « mid » qui est structuré en poche de liaison pour le 5'- phosphate du miARN, et le domaine catalytique PIWI qui fonctionne comme une RNase-H et possède une activité endonucléolytique dans Ago2. Le domaine mid et PIWI interagissent avec la protéine GW182. (B) La protéine TNRC6A est représentée comme un exemple parmi les membres de la famille des protéines GW182. Les protéines GW182 contiennent deux domaines globulaires : un domaine (UBA) (ubiquitin-associated-like domain) et un motif de reconaissance d’ARN (RRM). Ces domaines sont intégrés de manière non structurée dans les régions N- terminals (mid ) et C-terminal, avec un nombre variable de répétitions glycine - tryptophane (GW). La plupart des répétitions sont situées dans la région N - terminale, qui augmente l’affinité de liaison aux protéines Ago. Le domaine mid est divisé en deux zones M1 et M2 séparées par un motif PAM2. La protéine GW182 contient aussi une région riche en glutamine « Q- rich ».

A

B

46  Maturation indépendante de Dicer

Plusieurs équipes ont montré une maturation indépendante de Dicer pour le miARN miR- 451 (Cheloufi, Dos Santos et al. 2010 ; Cifuentes, Xue et al. 2010 ; Yang, Maurin et al. 2010). L’examen de la structure du précurseur de miR-451 et de son miARN mature à révélé une caractéristique inhabituelle. Les six dernier nucléotides du mir-451 mature se prolongent tout au long de la tige boucle et s’étendent jusqu’au brin complémentaire, ce qui donne naissance à un miARN mature unique sans brin passager (Cheloufi, Dos Santos et al. 2010). Ces équipes ont montré que la structure du pré-miR-451 de 18 paires de bases était trop courte pour être prise en charge par Dicer (Siolas, Lerner et al. 2005), ce dernier étant pris en charge directement par Ago2 qui va cliver le pré-miR sur le bras 3’ de la tige boucle, donnant naissance à un miARN mature unique (Yang and Lai 2011).