II.1. Echantillonnage des COVs
Sur le terrain, 20 mg environ de feuilles ont été coupées et placées dans un pilulier en verre (10 mL) immédiatement fermé avec un bouchon contenant un septum en téflon (Varian Instruments, Sunnyvale, CA, USA). Un échantillon d’écorce de 1cm² était de la même manière mis dans un pilulier séparé (Figure 18 (a)). Tous les piluliers étaient conservés au froid et mis dès que possible au congélateur à -20°C où ils étaient conservés jusqu’à analyse.
L’extraction des COVs a été faite en utilisant la technique de SPME (« Solid Phase Micro Extraction ») qui utilise l’adsoption des composés sur une fibre de silice recouverte d’un adsorbant particulier (Lord & Pawliszyn 2000; Mayer et al. 2008; Tholl et al. 2006). Dans une étape préliminaire (E. Courtois, master 2, 2007), nous avons montré que les fibres de type PDMS/DVB (Polydimethylsiloxane/ Divinylbenzene) 65 µm (Supelco, Bellefonte, PA, USA) était plus efficace que d’autres type d’adsorbants ce qui est cohérent avec la littérature (Bouvier-Brown et al. 2007; Guo et al. 2006). Les fibres étaient conditionnées avant première utilisation 30 minutes à 250°C comme recommandé par le constructeur. Avant extraction, les piluliers fermés contenant les échantillons de tissus (feuille ou écorce) étaient placés à température ambiante pendant au moins une heure. La fibre SPME était ensuite placée dans le pilulier pendant 5 à 60 minutes en fonction des espèces (Courtois et al. 2009), toujours à température ambiante (Figure 18(a)).
En utilisant quatre espèces (Protium sp. Burseraceae, Inga sp. Mimosaceae, Guarea
sp. Meliaceae, Spondias mombin Anacardiaceae), nous avons vérifié que le mélange de COVs
extrait avec cette technique des piluliers était représentatif du mélange émis par le tissus lors d’une blessure mécanique (Courtois et al. 2009). Pour trois individus par espèce, nous avons donc extrait par fibre SPME les COVs émis directement sur le terrain (Figure 18(b)) en enfermant la partie blessée (feuille ou écorce) dans un sac téflon (Bouvier-Brown et al. 2007). Pour les mêmes individus, nous avons prélevé un échantillon de feuille et un échantillon d’écorce dans des piluliers stockés à -20°C selon la technique présentée précédemment. Les mélanges qualitatifs (présence/absence de composés) retrouvés dans les deux méthodes et
pour les deux tissus (feuille et écorce) étaient identiques avec les deux techniques d’échantillonnages.
Figure 18: Echantillonnage des COVs
(a) Echantillonnage des COVs pour le projet BRIDGE pour feuille et écorce : (b) Validation de la technique d’échantillonnage utilisée dans le projet BRIDGE
II.2. Analyses chimiques
Analyse des COVs – L’ensemble des analyses de COVs a été réalisé sur un chromatographe
en phase gazeuse Varian 3800 (GC) associé à un spectromètre de masse Saturn 2000 (MS; Varian Instruments, Sunnyvale, CA, USA) au centre de l’Institut Pasteur de Cayenne (Guyane française) entre septembre 2007 et avril 2009. La technique de GCMS permet de séparer les constituants d’un mélange de composés volatils par migration dans une colonne puis de proposer une aide à l’identification des molécules ainsi séparées grâce à la fragmentation des molécules. Le détail des conditions d’analyse peut être consulté dans le manuscrit 1 (Courtois
et al. 2009).
colorimétriques basés sur des changements d’absorbance en fonction de la quantité de tannins contenus dans un mélange après ajout d’un réactif adapté. D’autres tests plus complexes utilisent la capacité des tannins à précipiter les protéines et mesurent le degré de précipitation en fonction de la quantité de tannins. Ces tests de précipitation sont plus adapté pour déterminer le « pouvoir précipitant » d’une certaine quantité de tannin mais ils sont souvent plus longs et difficiles à mettre en place. Dans le cadre de cette thèse, nous avons utilisé un test colorimétrique, le test de Folin-ciolcateu, qui malgré des critiques quand à sa reproductibilité (Appel et al. 2001), reste utilisé dans de nombreuses études du fait de sa facilité de mise en place (Makkar 2000).
Extraction des tannins – Les tannins peuvent être extraits en utilisant comme solvant
l’acétone 70% ou le méthanol 50% (Hagerman 1988). L’extraction à l’acétone est légèrement plus éfficace mais l’acétone étant un solvant très volatil, le mélange est beaucoup moins stable qu’en utilisant le méthanol. Les conditions d’analyses nécessitant le transport des échantillons d’un laboratoire à l’autre entre l’extraction et l’analyse, nous avons décidé d’utiliser un extrait méthanolique (Makkar 2000). 100 mg de feuilles séchées à l’air libre puis broyées finement ont été extrait dans 5mL de méthanol 50% par agitation toute une nuit. Le mélange a ensuite été filtré sur papier filtre (papier filtre Whatman n°1) et le filtrat récupéré et conservé au réfrigérateur (4°C) jusqu’à analyse.
Dosage du contenu en composés phénoliques totaux – Pour le dosage des composés
phénoliques totaux, dans un tube à hémolyse en verre, le mélange suivant a été réalisé en double : 500µL d’extrait, 200 µL de réactif de Folin (Sigma-Aldrich, Milwaukee, USA) dilué par deux et 1.25 mL d’une solution de carbonate de sodium à 20%. Les tubes ont été ensuite fermés, vortexés et placés à l’obscurité à température ambiante pendant 40 minutes. L’absorbance a finalement été mesurée à 725 nm. Si le mélange était trop concentré en tannin (quantité de tannin supérieure au maximum de la gamme étalon), la solution était dilué au 1/10.
Dosage du contenu en tannins – Pour déterminer la proportion des phénols totaux qui sont des
tannins, les tannins ont été précipités en utilisant du polyvinyl polypyrrolidone (PVPP, Sigma- Aldrich, Milwaukee, USA). La quantité de tannins se déduit donc en faisant la différence des
phenols totaux mesurés avant et après précipitation avec le PVPP. Dans un tube eppendorf de 2 mL, 100mg de PVPP a été pesé avec 1mL d’extrait dilué au 1/10 et 1 mL d’eau distillé. Les tubes ont été ensuite vortexés et mis au frigo (4°C) pendant 15 minutes puis centrifugés à 3000 tour par minute pendant 10 minutes. Le dosage des phénols totaux (comme présenté précédemment) a ensuite été réalisé sur le surnageant en mélangeant 100 µL de surnageant, 400 µL d’eau distillée, 250µL de réactif de folin et 1.25 mL de carbonate de sodium.
Réalisation de la gamme étalon – La gamme étalon a été réalisée en utilisant des solutions
d’acide tannique (Sigma-Aldrich, Milwaukee, USA) de concentrations connues (0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 et 0.1 mg.mL-1). y = 0.046x R2 = 0.9991 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 2 4 6 8 10 12
quantité d'acide tannique (µg)
abs or ba nc e à 725 nm
Figure 19: Courbe d'étalonnage réalisée pour les dosages de tannins
II.3. Méthodes statistiques
Aide à la détermination de la composition en COVs : le package R Mseasy – Pour aider au
traitement des nombreuses analyses de COVs utilisées dans cette thèse, j’ai travaillé en collaboration avec F. Nicole et Y. Guitton du LBVPAM (Laboratoire de Biotechnologies Végétales appliquées aux Plantes Aromatiques et Médicinales) de Saint-Etienne au développement d’une technique statistique permettant un regroupement des molécules sur la base de leur spectre de masse. Pour une description complète de cette méthode, voir l’annexe 1 (Nicole et al. in prep). Cette méthode a donné lieu à la proposition d’un package R (MSeasy) qui sera disponible sur le site du CRAN (http://cran.r-project.org/).